ГОСТ Р 53244— 2008
D.2.6.2 Термоциклер
Отмеченный температурно-временной профиль изначально был оттестирован с приборами СДП ABI
PRISM* 7700 и СДП GeneAmp* 5700 (Applied Blosystems). Допускается использовать другие системы детектирова
ния ПЦР в реальном времени после адаптации реакционных условий.
0.2.6.3 Реакционные пробирки
Реакционные пробирки должны быть подходящими для ПЦР-амплификации в термоциклере реального вре
мени. например. ABI PRISM* 96-Well Optical Reaction Plate или МюгоАтр* Optical Caps (восемь крышек/полоска.
плоская) (Applied Blosystems).
Д
о
пу
с
к
а
е
тс
я
п
р
и
м
е
н
е
ни
е
др
у
г
их
ср
е
дств
и
зм
е
р
е
ний
с м
е
тро
л
ог
ич
е
с
к
и
м
и
х
ара
к
т
е
р
и
ст
и
к
ам
и
,
а та
к
ж
е
обор
у
дова
ния
и
р
е
а
к
т
и
вов с т
е
хнич
е
с
к
и
м
и
х
ара
к
т
е
р
и
ст
и
к
ам
и
н
е
ни
ж
е
в
ыш
е
у
к
аза
нных
,
е
с
ли
мож
е
т б
ы
ть
п
о
к
аза
н
о
.
ч
то
их
п
р
и
м
е
н
е
ни
е
п
р
и
вод
и
т
к
т
е
м ж
е
р
е
з
ул
ьтатам
.
0.2.7 Процедура: порядок проведения ПЦР
D.2.7.1 Общие положения
Порядок проведения ПЦР для такон-специфической целевой последовательности и для целевой последова
тельности ГМО проводят в отдельных пробирках. Мультиплексная ПЦР (с использованием различных флуоресцен
тных меток для зондов) не была протестирована или валидирована.
Метод приведен для суммарного объема реакционной смеси ПЦР 25 мкл с реактивами, список которых при
веден в таблице 0.3.
Т а б л и ц а 0.3 — Реакционная смесь амплификации в окончательном объеме на одну реакционную пробирку
Суммарный объем реакции25 мкл
Добавленная кодирующая нить ДНК (2.3 нг к 150 нг ДНК кукурузы)5 мкл
ДНК-полимераза
AmpllTaq Gold*
1.25 ед.
Деконтаминационная система
ДУТ®
Урацил-1У-гликозилаза AmpErase*
400 мкмоль/дм3
0.5 ед.
Реакционный буфер
Буфер A TaqMan* (содержащий пассивный стандартный
ROX)*
1*
МдС1г
6.5 ммоль/дм3
Праймеры
См. таблицу D.2
См. таблицу D.2
дНТФ
дАТФ. дЦТФ, дГТФ
200 мкмоль/дм3
каждого
Зонды
См. таблицу D.2
См. таблицу D.2
* ROX — карбокси-Х-родамин.
D.2.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительного контроля и стандартного калибровочного материала может быть использован
сертифицированный стандартный материал MON 810 (материал, содержащий от < 0.02 % до 5 % генетически мо
дифицированной кукурузы), изготовленной IRMM, Geel. Belgium (серии IRMM-413).
Следует использовать все соответствующие контроли. как это определено в
ГО
С
Т
Р
53214
D.2.7.3 Температурно-временная программа
Температурно-временная программа, приведенная в таблице D.4. была оптимизирована для СДП АВ1
PRISM* 7700 (Applied Biosystems). В валидационном исследовании она была использована в сочетании с ДНК-по-
лимеразой AmpllTaq Gold®’. Использование других термоциклеров может потребовать специфической адаптации.
Время для активации/первоначальной денатурации зависит от используемой полимеразы.
Условия реакции приведены в таблице О.*.
Т а б л и ц а D.4 — Процедура: условия реакции
Э
та
пы
о
п
р
е
д
е
л
е
ния
время, с
Температура. ’С
Пред-ПЦР: деконтаминация
120
50
Пред-ПЦР: активация ДНК-полимеразы и денатурация кодирующей нити ДНК
600
95
55