ГОСТ Р 53244— 2008
Т а б л и ц а С.10 — Процедура: условия реакции
Этапы
о
п
р
е
д
е
л
е
ния
Время, сТемпература. "С
Пред-ПЦР: деконтаминация (необязательно)12050
Пред-ПЦР: активация ДНК-полимеразы и денатурация кодирующей нити ДНК60095
ПЦР (45 циклов)
Стадия 1
Денатурация
15\5Ь95
Стадия 2
Отжиг и элонгация
60*/25“60
а Оптимизировано для ABI PRISM* 7700 (Applied Biosystems).
6 Оптимизировано для системы LightCycler*. Параметры флуоресценции a LightCycler* — канал 1(коэффици-
ент усиления 4) и единичный сбор данных с программным обеспечением версии 3.
С.2.8 Ограничения и интерпретация результатов
Так как некоторые ГМО. а не только соя линии GTS 40-3-2, могут содержать часть генетической конструкции,
использовавшейся для конструирования сои линии GTS 40-3-2. в частности, специфическое соединение между
ЗбЗ-промотором и СТР-сигнальной последовательностью из
Pe
t
un
ia
hy
brid
s,
метод пригоден только для количес
твенного определения ДНК сои линии GTS 40-3-2 в отсутствии других ГМО. как определено выше.
Приведенный метод пригоден для измерения соотношения ДНК. специфической для сои линии GTS 40-3-2 и
ДНК обычной сои. Это соотношение отражает количество сои линии GTS 40-3-2 в соевом ингредиенте исследуемо
го пищевого продукта.
Этот метод был аалидироаан для соевой муки и текстурированного растительного белка.
П р и м е ч а н и е — Если соевая ДНК была утрачена или сильно деградирована а ходе обработки пищевого
продукта при его приготовлении (например, при получении рафинированного соевого масла) или если соя является
только очень минорным компонентом анализируемого образца, количество соевого стандарта и/или ГМ-специфи-
ческих копий будет на уровне или ниже предела количественного определения, и описанные методы не будут при
менимыми.
С.2.9 Калибровка и расчет результатов
Отдельные калибровочные кривые для каждой системы праймер/зонд генерируются в ходе одного и того же
аналитического амплификационного пробега. Калибровочные кривые включают четыре разбавления ДНК. экстра
гированной из 5 %-ного ССМ IRMM-410R. В каждой из четырех калибровочных точек проводилось дублирующее
(СДП ABl PRISM* 7700) и СДП GeneAmp’ 5700 или одиночное (система LightCycler*)определение. Тройные реак ции
с использованием соответствующих разбавлений ДНК. экстрагированной из неизвестного образца, измеряли с
помощью инструментов ABI. в то время как единичные определения с использованием двух различных разбавле ний
экстракта ДНК образца проводились с помощью системы LightCycler*.
Калибровочная кривая получается путем построения графика зависимости значений Ct от логарифма числа
копий целевой последовательности для калибровочных точек. Это может быть осуществлено, например, путем ис
пользования программного обеспечения (электронной таблицы), такого как Microsoft Excel, или напрямую с по
мощью опций, доступных в программном обеспечении системы детектирования последовательностей.
Число копий, измеренное для ДНК неизвестного образца, получается путем интерполяции из стандартных
кривых. Для определения количества ДНК сои линии GTS 40-3-2 в неизвестном образце число копий целевой по
следовательности GTS 40-3-2 делится на число копий гена лектина и умножается на 100. после чего выражается в
процентах.
Раздел С.З. Не включен (см. предисловие).
С.4 Метод количественного определения содержания ДНК сои линии GTS 40-3-2 (специфический для
конструкции) с использованием ПЦР в реальном времени
С.4.1 Введение
В этом приложении приведен метод обнаружения и количественного определения таксон-специфического
гена сои (ген лектина. /е1) и специфического участка ДНК конструкции — места соединения последовательности
хлоропластного транзитного пептида
Pe
t
un
ia
hy
brida
и гена 5-енолпирувилшикимат-З-фосфат-синтазы
A
grobact
e
ri
um
(
e
p
s
p
s
). присутствующего в генетически модифицированной (ГМ) сов линии GTS 40-3-2 (соя Roundup
Ready*. RRS). Метод основан на ПЦР в реальном времени с использованием плазмиды pMulSL2 в качестве стан
дартного материала для количественного определения относительного количества GTS 40-3-2 в сое с использова
нием конверсионного фактора (С/), представляющего собой отношение числа копий GTS 40-3-2-специфических и
таксон-специфических последовательностей ДНК а образце семян истинной сои линии GTS 40-3-2.
П р и м е ч а н и е — Cl1используется для расчета содержания ГМО (мае. %) из числа копий ДНК ГМО целе
вой и таксон-слвцифической последовательностей.
C
t
может быть измерен как отношение числа копий для целе-
27