ГОСТ Р 53244— 2008
С.4.2.3 Молекулярная специфичность
С.4.2.3.1 Общие положения
Этот метод был приведен в
[28]
.
Информация о генетической конструкции, встроенной в геном сои, доступна
в
[28]
и [25]. Последовательности ДНКдля разработки этого метода могут быть получены, например, в DDBJ, регис
трационный номер базы данных Х04879. в отчете (37) и в патенте Соединенных Штатов Америки, номер
5633435.
Если ДНК-конструкция, встроенная в GTS 40-3-2, использована в других ГМ-событиях. может быть получен
ложноположительный результат, поскольку амплифицируемая последовательность происходит из этой конструк
ции.
С.4.2.3.2 Теоретическая специфичность
Теоретическая специфичность праймеров и зондов была оценена путем поиска в базах данных DDBJ [3 де
кабря 1999 г.) и документация по оценке безопасности была опубликована Министерством здоровья, труда и благо
получия (Япония) и Министерством сельского хозяйства, лесного хозяйства и рыболовства (Япония) с
использованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных последовательностей с помощью про
граммы BLASTN 2.2.3. Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемой целевой после
довательностью.
С.4.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности
Амплификация с праймерами и зондами, приводящая к получению ожидаемых ПЦР-продуктов при исследо
вании с образцами высушенной соевой муки, содержащей от 0 % до 10% (по массе) ГМ сои линии GTS 40-3-2. кото рые
были приготовлены для этого метода NFRI [28]. [29].
Проведенные перед совместным испытанием лабораторий тесты на специфичность показали отсутствие пе
рекрестной реактивности детекторной системы со следующими нецелевыми видами/образцами — рисом
[Ог
у
га
s
ali
v
a
), пшеницей
(Trttic
um
a
es
li
vum
)
и ячменем (
H
ord
e
um
vu
lgar
e
)
.
Не наблюдали перекрестной реактивности со
следующими линиями ГМ-кукурузы — MON 810, Event176. ВМ1, GA21 и Т25.
С.4.2.4 Оптимизация
Оптимизация реактивов была проведена для СДП ABl PRISM 7700*’ с использованием
н
абора
TaqMan* хи
мия (38).
Расчет праймеров и зондов был проведен с помощью программного обеспечения Primer Express* (Applied
Biosystems).
С.4.2.5 Предел детектирования (LOD)
Абсолютный предел детектирования в соответствии с указаниями разработчика метода — 20 копий плазмид
стандартного материала
[28]
.
Относительный LOD, валидированный в ходе совместного испытания лабораторий. — 0.1
%
сои линии
GTS 40-3-2.
С.4.2.6 Предел количественного определения (LOQ)
Абсолютный LOQ в соответствии с указаниями разработчика метода — 20 копий плазмид стандартного мате
риала.
Относительный LOQ. валидированный в ходе совместного испытания лабораторий. — 0.1 % сои линии
GTS 40-3-2.
С.4.3 Адаптация
Специфическая информация отсутствует.
С.4.4 Принцип
Фрагмент последовательности, специфической для конструкции сои линии GTS 40-3-2, размером 121 п. о.
амплифицировали с помощью ПЦР пары праймеров, специфических для GTS 40-3-2. ПЦР-продукты измерялись в
ходе каждого цикла ПЦР (в реальном времени) с помощью олигонуклеотидного зонда, специфического для ко
нструкции GTS 40-3-2. меченного двумя флуоресцентными красителями — FAM в качестве репортерного красите
ля и TAMRA в качестве гасителя. Для этих целей применялся
н
абор
TaqMan* химия.
Фрагмент последовательности таксон-специфического гена пектина сои
{
L
a
1) размером 118 п. о. был ампли-
фицирован с помощью ПЦР а отдельной реакции ПЦР в реальном времени с использованием двух праймеров, спе
цифических к гену Le1. и продукты ПЦР измерялись в течение каждого цикла ПЦР с применением зонда,
специфического к гену Lei. производства TaqMan*.
Для количественного определения числа копий в экстрагированной ДНК из экстрактов ДНК неизвестного ис
пытательного образца был использован метод калибровочной кривой. Отдельные калибровочные кривые с каждой
системой лраймер/зонд генерировались в ходе одного и того же прогона аналитической амплификации. Калибро
вочные кривые составляли из пяти концентраций, включая 20. 125. 1500. 20000. 250000 копий ДНК плазмиды
pMulSL2. В каждой из пяти калибровочных точек проводились трехкратные измерения. Тройные реакции с исполь
зованием соответствующих разбавлений ДНК. экстрагированной из неизвестного образца, проводились на ABI
PRISM® 7700 SDS (Applted Bsosystems) в том же самом аналитическом прогоне.
График зависимости значений С, («порогового цикла»), определенных для калибровочных точек в специфи
ческой для Le1 или целевой последовательности конструкции GTS 40-3-2. соответственно, от логарифма числа ко
пий ДНК плазмиды pMulSL2
[28]
.
использовали для построения калибровочной кривой. Число копий, определенное
30