ГОСТ Р 53244— 2008
С.8.9 Калибровка и расчет результатов
Исследователем должно быть определено пороговое значение для определения порогового цикла (С,).
Пример процедуры после ПЦР-анализа можно найти в руководстве производителя к стандартным мате
риалам ГМ-кукурузы (GM Maize Detection Plasmid Set (Fasmac No. PS-2 и Nippon Gene No. 319-04981). См. так
же [28].
Конверсионный фактор (СОдля количественного определения конструкции, специфическойдля линии GA21.
и референсной плазмиды, использовавшихся в совместном испытании лабораторий, равен 1.40.
Расчет количества ГМ-кукурузы.
%
.
в матриксе образца, проводят по формуле
100
C
f
<
С
.
<)
q
где
N
"
— число копий ГМ-специфической целевой последовательности ДНК испытательного образца;
N
,
x
—
число копий таксон-специфической целевой последовательности ДНК испытательного образца.
С.9 Метод количественного определения содержания ДНК кукурузы линии Т25 (специфический для
конструкции) с использованием ПЦР в реальном времени
С.9.1 Введение
В этом приложении приведен метод обнаружения и количественного определения таксон-специфического
гена кукурузы (ген синтазы крахмала кукурузы. Ilt>:
zSSlIb)
и специфического участка ДНК-конструкции — места сое
динения между последовательностью промотора вируса мозаики цветной капусты и синтетическим геном фосфи-
нотрицинацетилтрансферазы (paf). происходящего из
Str
e
pto
my
c
es
v
ir
k
toc
h
ro
m
og
e
n
es
и присутствующего в
ГМ-кукурузе линии Т25. на основе ПЦР в реальном времени с использованием плазмиды в качестве стандартного
материала для определения относительного количества Т25 с применением конверсионного фактора (
C
f
). пред
ставляющего собой отношение числа копий специфических для конструкции и таксон-специфических последова
тельностей ДНК в репрезентативном образце семян истинной кукурузы линии T2S.
П р и м е ч а н и е —
C
f
используется для расчета содержания ГМО (мае. %)из числа копий ДНК ГМО целе
вой и таксон-специфической последовательностей.
C
f
может быть измерен как отношение числа копий для целе
вой последовательности и таксон-специфической последовательности из соответствующего стандартного
материала.
Ограничения см. в С.9.8.
С.9.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров
С.9.2.1 Общие положения
Этот метод был оптимизирован для прибора СДП ABI PRISM® 7700 ПЦР в реальном времени с использовани
ем плазмиды pMulS в качестве стандартного материала (28). Плазмида рМи!5 включает, в частности. ПЦР-продук-
ты. амплифицированные из систем ПЦР для специфической амплификации таксон-специфической
последовательности из кукурузы (
zSSIIb
). последовательности 355-промотора вируса мозаики цветной капусты
(p3SS), терминаторной последовательности нопалин-синтазы (tNOS). и последовательности, специфической для
конструкций MON 810. Eventl 76. Bt11. GA21 и Т25.
П р и м е ч а н и е — Плазмида использовалась в качестве калибровочного материала для определения со
держания ГМО. рассчитанного из относительного числа копий ГМ-специфической и таксон-специфической после
довательностей ДНК.
Воспроизводимость и точность описанного метода была проверена а ходе совместных испытаний лаборато
рий с использованием стандартных материалов и неизвестных образцов высушенной муки семян кукурузы, содер
жавших смеси зерен линии Т25 и обычной кукурузы [29].
Число копий таксон-специфической последовательности
(zSSIIb)
в расчете на геном оценивалось для
20 представительных разновидностей кукурузы.
Метод был опубликован в японском и корейском национальных стандартах [30]. [31]. [32]. [33].
С.9.2.2 Совместные испытания лабораторий
Всего 12 неизвестных образцов кукурузы, содержавших от 0 % до 10 % (по массе) высушенной кукурузной
муки, полученной из кукурузы линии Т25. были проанализированы 15 участниками.
П р и м е ч а н и е — Для определения величин
C
f
и приготовления неизвестных образцов для совместного
испытания лабораторий были использованы семена образца линии Т25. гетерозиготной по ГМ-вставке. Для ва
лидации были приготовлены неизвестные образцы смесей кукурузной муки, которые содержали 0 %. 0.1 %. 0.5 %. 1
%. 5 % и 10 % (по массе) сухой кукурузной муки, полученной из этой линии. Гомогенность образцов на каждом
уровне была протестирована с использованием количественного метода в соответствии с протоколом АОАС [29].
1341-
Валидация метода для кукурузы линии Т25 была проведена путем совместного испытания лабораторий в со
ответствии с протоколом АОАС (34). Совместное испытание лабораторий было организовано Национальным
45