ГОСТ Р 53244— 2008
Расчет праймеров и зондов был проведен с помощью программного обеспечения Primer Express® (Applied
Biosystems).
В.1.2.5 Предел детектирования (LOO)
Поскольку метод является количественным. LOD прямо не оценивался. LOD должен быть лучше или рав
ным пределу количественного определения, т. е. 50 геномных копий сои линии GTS 40-3-2 в 82000 геномных ко
пиях обычной соевой муки.
В.1.2.6 Предел количественного определения (LOQ)
LOQ был определен путем измерения серии разбавлений целевой ДНК. как описано в (23). В соответствии с
рекомендациями разработчика метода LOO составляет 50 геномных копий сои линии GTS 40-3-2 в 82000 геномных
копиях обычной соевой муки. Величину 1C см. в [23] 8 соответствии с этими данными оцененный относительный
LOQ составляет 0.06 (= 50 копий/82000 копий х 100 %).
Концентрации, исследованные в совместном испытании лабораторий, приведены в таблице В.1.
П р и м е ч а н и е — Число копий в совместном испытании лабораторий не определялось.
В.1.3 Адаптация
Специфическая информация отсутствует.
В.1.4 Принцип
Фрагмент последовательности CaMV 35Б-промотора размером 82 п. о. был амплифицирован с помощью
ПЦР двух Збв-лромотор-специфических праймеров. ПЦР-продукты измерялись в ходе каждого цикла ПЦР (в ре
альном времени) с помощью Збв-промотор-специфического олигонуклеотидного зонда, меченногодвумя флуорес
центными красителями — РАМ в качестве репортерного красителя и TAMRA в качестве гасителя. Для этих
целей применялся набор TaqMan® химия.
Фрагмент последовательности гена лектина сои размером 81 л. о. был амплифицирован с помощью ПЦР в
отдельной реакции ПЦР в реальном времени с использованием двух праймеров, специфических кгенусоевого лек
тина. и продукты ПЦР измерялись в течение каждого цикла ПЦР с применением зондов, специфических к гену сое
вого лектина, производства TaqMan*\
Количественное определение проводили с использованием метода ддС,ипи метода двойной калибровочной
кривой (см. В.1.9).
В.1.5 Реактивы
В.1.5.1 Общие положения
Для получения информации о качестве используемых реактивов см. ГОСТ
Р
53214
(
п
одразд
е
л
6
.
6)
.
В.1.5.2 Вода.
В.1.5.3 буфер для ПЦР (без МдС12). 10’.
В.1.5.4 Раствор MgCI2. c{MgCL.) = 25 ммоль/дм3.
В.1.5.5 Раствор дНТФ. с(дНТФ) = 2.5 ммоль,’дм5(каждый).
В.1.5.6 Олигонуклеотиды
Хара
к
т
е
р
и
ст
и
к
и
применяемых олигонуклеотидов приведены в таблице В.2.
Т а б л и ц а В.2 — Олигонуклеотиды
ДНК последовательность олигонуклеотида
Наименование
олигонуклеотида
Окончательная
концентрация при ПЦР
Целевая последовательность референсного гена
Лектин-F
5’-ТСС ACC ССС АТС САС ATT Т-3’
900 нмоль/дм3
Лектин -R
5’-ggC АТА дАА ддТ дАА дТТ дАА ддА-3’
900 нмоль/ дм5
Лектин -ТМР
S’-FAM-AAC Сдд ТАд СдТ ТдС САд СТТ Cg-TAMRA-3"*
100 нмоль/дм-*
Целевая последовательность ГМО
35S-F
5 -дСС ТСТ дСС дАС АдТ ддТ-3’
300 нмоль/дм-1
35S-R
5 -ААд АСд Тдд ТТд дАА СдТ СТТ С-3’
900 HMonb/flMJ
3SS-TMP
S’-FAM-CAA АдА Тдд АСС ССС АСС САС д-ТАМЛА-З’
100 HMonb/flMJ
* FAM: 6-карбоксифлуоресцеин. TAMRA: 6-карбокситетраметилродамин.
Длина пектинового ПЦР-лродукта составляет 81 п. о.; длина 35S ПЦР-продукта составляет 82 п. о.
В.1.5.7 Термостабильная ДНК-полимераза
ДНК-полимераза AmpliTaq Gold®.
13