ГОСТ Р 53244— 2008
Т а б л и ц а С.27 — Реакционная смесь амплификации для специфической последовательности GA21 в
окончательном объеме в расчете на одну реакционную пробирку
Суммарный реакционный обьем
25 мкл
Кодирующая нить ДНК (50 нг геномной ДНК кукурузы)
2.5 мкл
Реакционный буфер (вклю Универсальная смесь для ПЦР чая
ДНК-полимеразу и дНТФ) Universal Master Mix (ABI) TaqMan*
12.5 мкл
Праймеры
GA21 2-5’and GA21 2-3’(см. таблицу C.25)
См.таблицу С.25
Зонд
GA21-2-Taq (см. таблицу C.25)
См.таблицу С.25
С.8.7.2 Контроля ПЦР
Каждая серия испытаний должна включать все контроли. как это определено в
ГО
С
Т
Р
5
3214
.
Если контроли не дадут ожидаемых результатов, результаты испытаний должны быть забракованы и анализ
должен быть повторен.
В качестве положительного контроля/стандартного калибровочного материала доступны по крайней мере
две альтернативы, а именно:
a) высококачественная чистая геномная ДНК. экстрагированная из зерен кукурузы, может быть использова
на. если количество ДНК известно на основе расчета числа копий целевой последовательности, исходя из размера
генома кукурузы линии GA21;
b
) плазмида, содержащая целевую(ые) последовательность(и), может быть добавлена в различных концен
трациях с известным числом копий. Такая плазмида доступна в наборе GM Maize Detection Plasmid Set (Fasmac No.
PS-2 и Nippon Gene No. 310-04981) (28).
Всоответствии с требованиями обеспечения качества положительные контроли предпочтительно не должны
быть теми же самыми, что и стандартные калибровочные материалы.
С.8.7.3 Температурно-временная программа
Температурно-временная программа, приведенная в таблице С.
28
,
была оптимизирована для СДП ABI
PRISM* 7700 (Applied Biosystems). В валидационном исследовании он использовался совместно с универсальной
смесью для ПЦР TaqMan® Universal Master Mix. Использование других термоциклеров может потребовать специ
альной адаптации. Время, необходимое для активации/инициации денатурации, зависят от особенностей исполь
зуемой смеси Master Mix.
Т а б л и ц а С.28 — Условия реакции
Э
та
пы
о
п
р
е
д
е
л
е
ния
Время, с
Температура. ’С
Пред-ПЦР: деконтаминация
120
50
Лред-ПЦР: активация ДНК-полимеразы и денатурация кодирующей нити ДНК
600
95
ПЦР (40 циклов)
Стадия 1
Денатурация3095
Стадия 2
Отжиг и элонгация6095
С.8.8 Ограничения и интерпретация результатов
Так как разные линии ГМ-кукурузы, а не только кукуруза линии GA21. могут содержать ту же самую специфи
ческую для конструкции последовательность ДНК. метод пригоден только для количественного определения ДНК
кукурузы линии GA21 в отсутствие ГМО. иных, чем кукуруза линии GA21.
Приведенный метод пригоден только для определения соотношения последовательности, специфической
для конструкции линии GA21. и таксон-специфической гЗБ/УР-последовательности кукурузы. Это соотношение
отражает количество GA21 в исследуемом образце кукурузы. Этот метод был валидирован только для зерен куку
рузы.
Совместное испытание лабораторий является значимым источником данных для обеспечения оценки по
грешности. Также необходимо идентифицировать любые источники погрешностей, которые не охватывают меж
лабораторные испытания, такие как отбор проб и др., в соответствии с основными международными
договоренностями (39). (40).
44