ГОСТ Р 53244— 2008
А.1.3 Адаптация
Специфическая информация отсутствует.
А.1.4 Принцип
Фрагмент гена
ad
h
1 а 134 п. о. амплифицировапи с использованием двух кукурузных ad/Л-специфических
праймеров (см. таблицу А.2). Накопление продуктов ПЦР измеряли в конце каждого цикла ПЦР (в реальном време ни)
с помощью кукурузного adftl-специфического олигонуклеотидного зонда (ADH1-MDO. см. таблицу А.2), мечен ного
двумя флуоресцентными красителями — FAM в качестве репортерного красителя и TAMRA в качестве гасителя.
Для этих целей применялся набор TaqMan* химия.
Измеренный сигнал флуоресценции пересекал определяемое пользователем пороговое значение после не
скольких циклов. Число этих циклов было названо С,-значением. Для количественной оценки количества кукурузной
аОЛ1-ДНК а неизвестном образце значение С, преобразовано а
соотв
е
тств
ующ
ее
чи
с
л
о
копий путем сравнения с
калибровочной кривой, значения С,на которой напрямую связаны с известным числом копий (регрессионный анализ).
А.1.5 Реактивы
А.1.5.1 Общие положения
Для получения информации о качестве реактивов, которые могут использоваться, см.
ГО
С
Т
Р
53214 (
п
одраз
-
д
е
л
6
.
6)
.
А.1.5.2 Вода.
А.1.5.3 Буфер для ПЦР (без MgCI2). 10«.
А.1.5.4 Раствор МдС1г. с(МдС1г) = 25 ммоль/дм*.
А.1.5.5 Раствор дНТФ, с(дНТФ) = 2,5 ммоль/длк* (каждый).
A.1.S.6 Олигонуклеотиды
Хара
к
т
е
р
и
ст
и
к
и
применяемых олигонуклеотидов приведены в таблице А.2.
Т а б л и ц а А.2 — Олигонуклеотиды
Наименование
олигонухлеотида
Последовательностьолигонухлеотидмой ДНК
Окончательная концентрация
при ПЦР
ADH-FF3
5-CgT СдТ ТТС CCA ТСТ СТТ СОТ СС-3’
300 нмоль/Фи^
ADH-RR4
5-ССА СТО СдА дАС СОТ САд ТС-3’
300 нмоль/дм1
ADH1-MDO
5-FAM-AAT САд ддС ТСА ТТТ ТСТ СдС ТСС TCA-TAMRA-3-
200 нмоль/дм*
* FAM: 6-карбоксифлуоресцеин; TAMRA: 6-карбокситетраметилродамин.
Длина ампликона
ad
h
1составляет 134 п. о.
А.1.5.7 Термостабильная ДНК-полимераза
ДНК-лолимераза AmpllTaq Gold*.
А.1.5.8 Урацил-Ы-гликозилаза (необязательно)
А.1.5.9 Реакционная смесь для амплификации
Подробно о реакционной смеси для амплификации см. в таблице А.З.
Т а б л и ц а А.З — Реакционная смесь для амплификации, окончательные объем/концентрация на одну
реакционную пробирку
Суммарный реакционный объем
25 мкл
Кодирующая нить ДНК (максимум 250 нг)
5 мкл
Taq-ДНК-полимераэа
TaqMan® Universal Master Mix 2’
12.5 мкл
Деконтаминационная система (дУТФ, включая урацил-N-
гликозилазу)
Реакционный буфер (содержащий пассивный стандартный
ROX)“
Смесь дНТФ
Праймеры
См. таблицу А.2
См. А.1.5.6
Зонд
См. таблицу А.2
См. А.1.5.6
* ROX— карбокси-Х-родамин.
8