ГОСТ Р 53244— 2008
Т а б л и ц а С
.
20
— Реакционная смесь амплификации в окончательном объеме на одну реакционную
пробирку для целевой таксон-слецифической последовательности
zSSllb
Суммарный объем реакции25 мкл
Кодирующая нить ДНК (50 нг геномной ДНК кукурузы)2.5 мкл
Реакционный буфер (вклю
чая ДНК полимеразу и дНТФ)
TaqMan® Universal PCR Master Mix (ABI)
12,5 мкл
Праймеры
zSSlIb
-
S
’
и
zSSllb
-
У
(см. таблицу C.19)
См.таблицу С.
19
Зонд
zSSllb
-Taq (см. таблицу
C
.
19)
См.таблицу С.
19
Т а б л и ц а С.21 — Реакционная смесь амплификации для специфической последовательности MON 810 а
окончательном объеме в расчете на одну реакционную пробирку
Суммарный реакционный объем
25 мкл
Кодирующая нить ДНК (50 нг геномной ДНК кукурузы)
2.5 мкл
Реакционный буфер (вклю Универсальная смесь для ПЦР чая
ДНК полимеразу и дНТФ) Universal Master Mix (ABI) TaqMan*
12,5 мкл
Праймеры
MON 810 2-5’and MON 810 2-3’(см. таблицу C.19)
См.таблицу С.19
Зонд
MON 810-Taq (см. таблицу C.19)
См.таблицу С.19
С.5.7.2 Контроли ПЦР
Каждая серия испытаний должна включать все контроли. как это определено в
ГО
С
Т
Р
5
3214
.
Если контроли не дадут ожидаемых результатов, результаты испытаний должны быть забракованы и анализ
должен быть повторен.
В качестве положительного контроля/стандартного калибровочного материала доступны по крайней мере
две альтернативы, а именно:
a) высококачественная чистая геномная ДНК, экстрагированная из зерен кукурузы, может быть использова
на. если количествоДНК известно на основе расчета числа копий целевой последовательности, исходя из размера
генома кукурузы линии MON 810.
b
) плазмида, содержащая целевую последовательность (и) может быть добавлена в различных концентра
циях с известным числом копий. Такая плазмида доступна в наборе GM Maize Detection Plasmid Set (Fasmac No.
PS-2 и Nippon Gene No. 310-04981) (28).
Всоответствии с требованиями обеспечения качества положительные контроли предпочтительно не должны
быть теми же самыми, что и стандартные калибровочные материалы.
С.5.7.3 Температурно-временная программа
Температурно-временная программа, приведенная в таблице С.22. была оптимизирована для СДП ABI
PRISM6 7700 (Applied Biosystems). В валидационном исследовании он использовался совместно с универсальной
смесью для ПЦР TaqMan® Universal Master Mix. Использование других термоциклеров может потребовать специ
альной адаптации. Время, необходимое для активацииУинициации денатурации, зависит от особенностей исполь
зуемой смеси Master Mix.
Т а б л и ц а С.22 — Условия реакции
Э
та
пы
о
п
р
е
д
е
л
е
ния
Время, с
Температура, ’С
Пред-ПЦР: деконтаминация
120
50
Пред-ПЦР: активация ДНК-полимеразы и денатурация кодирующей нити ДНК
600
95
ПЦР (40 циклов)
Стадия 1
Денатурация3095
Стадия 2
Отжиг и элонгация6059
38