ГОСТ Р 53244— 2008
С.2.5.2 Вода.
С.2.5.3 Буфер для ПЦР (без МдС12), 10“.
С.2.5.4 Раствор МдС12. с(МдС12) = 25 ммоль/дм3.
С.2.5.5 Раствор дНТФ, с(дНТФ) = 2.5 ммоль/ дм3.
С.2.5.6 Олигонуклеотиды
Хара
к
т
е
р
и
ст
и
к
и
применяемых олигонуклеотидов приведены в таблице С.7.
Т а б л и ц а С.7 — Олигонуклеотиды
Наименование
о
ли
го
ну
к
л
е
от
и
дов
ДНК-последовательмость олигонуклеотида
Окончательная
концентрация при ПЦР
Целевая последовательность референсного гена
GM1-F
5 -ССА gCT ТСд ССд СТТ ССТ ТС-3’
600 нмоль/дм3
GM1-R
5’-Gaa ддС ААд ССС АТС ТдС ААд СС-3“
600 нмоль/дм3
СМ1-зонд
5-FAM-CTT САС СТТ СТА ТдС ССС ТдА САС-ТАМРА-З*
120 нмоль/дм3
Целевая последовательность ГМО
RR1- F
5’-САТ ТТд дАд Адд АСА СдС ТдА-3“
600 нмоль/дм3
RR1-R
5‘-дАд CCA ТдТ ТдТ ТАА ТТТ дТд СС-31
600 нмоль/дм3
RRI-эонд
S’-FAM-CAA gCT дАС ТСТ ТТС-ТАМРА-З"*
125 нмоль/дм3
* FAM: 6-карбоксифлуоресцеин: TAMRA: 6-карбокситетраметилродамин.
Длина пектинового ПЦР-лродукта и ПЦР-продукта сои линии GTS 40-3-2 составляет 74 п. о.
С.2.5.7 Термостабильная ДНК-лолимераза
НК-полимераза AmpIlTaq Gold*.
С.2.5.8 Урацил-Ы-гликозилаза (необязательно).
С.2.6 Прибор
С
.
2
.
6
.
1
Общие положения
Следует использовать стандартный лабораторный прибор, если не определено иначе.
С.2.6.2 Термоциклер
Отмеченные температурно-временные профили исходно были оттестированы при помощи приборов СДП
ABI PRISM* 7700 или СДП GeneAmp* 5700 (Applied Biosystems), или системой L»ghtCycler® (Roche Diagnostics). До
пускается использовать другие системы ПЦР в реальном времени, если они могут показать эквивалентные или
лучшие результаты.
С.2.6.3 Реакционные пробирки
Реакционные пробирки должны быть подходящими для ПЦР-амллификации в термоциклере, например. ABI
PRISM* 96-Well Optical Reaction Plate или MIcroAmp* Optical Caps
(вос
е
мь
крышек/полоска, плоская) (Applied
Biosystems) и капилляры LlghtCycter* (Roche Dlagnosbcs).
Д
о
пу
с
к
а
е
тс
я
п
р
и
м
е
н
е
ни
е
др
у
г
их
ср
е
дств
и
зм
е
р
е
ний
с м
е
тро
л
ог
ич
е
с
к
и
м
и
х
ара
к
т
е
р
и
ст
и
к
ам
и
,
а та
к
ж
е
обор
у
дова
ния
и
р
е
а
к
т
и
вов с т
е
хнич
е
с
к
и
м
и
х
ара
к
т
е
р
и
ст
и
к
ам
и
н
е
ни
ж
е
в
ыш
е
у
к
аза
нных
,
е
с
ли
мож
е
т б
ы
ть
п
о
к
аза
н
о
,
ч
то
их
п
р
и
м
е
н
е
ни
е
п
р
и
вод
и
т
к
т
е
м ж
е
р
е
з
ул
ьтатам
.
С.2.7 Процедура: порядок проведения ПЦР
С.2.7.1 Общие положения
Порядок проведения ПЦР для целевой последовательности референсного гена и целевой последователь
ности ГМО следует проводить в отдельных пробирках.
Мультиплексная ПЦР (с использованием различных флуоресцентных меток для зондов) не была протестиро
вана или валидирована.
Перед «количественным прогоном» проводили прогон ПЦР в реальном времени по крайней мере с двумя
разбавлениями ДНК. экстрагированной из испытательных образцов для обеих ПЦР-систем для контроля амплифи-
цируемости. Данные, полученные в ходе этого «контрольного прогона», использовали для контроля качества ДНК
(ингибирования). Значения С,, полученные из двух линейных разбавлений, должны быть пропорциональны опреде
ленному различию С, (ДС,). например, разбавление один к четырем приводит к значению дС,. равному приблизи
тельно 2. Меньшее значение дС, указывает на нелинейную амплификацию, которая может быть вызвана
ингибиторами ПЦР. Значение С, неизвестной ДНК. определенное в ходе контрольного прогона, дает также инфор
мацию о количестве целевой ДНК. Таким образом, выбирается подходящая концентрация ДНК неизвестного испы
тательного образца, которая должна находиться в диапазоне стандартной кривой.
25