ГОСТ Р 53244— 2008
С.5.2.3.2 Теоретическая специфичность
Теоретическая специфичность праймеров и зондов быпа оценена путем поиска в базах данных DDBJ (3 де
кабря 1999 г.), и документация по оценке безопасности была опубликована Министерством здоровья, труда и бла
гополучия (Япония) и Министерством сепьского хозяйства, лесного хозяйства и рыболовства (Япония) с
испопьзованием нуклеотидных последовательностей в качестве запросных последовательностей с помощью про
граммы BLASTN 2.2.3. Результат поиска подтвержден полной идентичностью только с ожидаемой целевой после
довательностью.
С.5.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности
Амплификация с праймерами и зондами, приводящая к получению ожидаемых ПЦР-продуктов при исследо
вании с образцами высушенной кукурузной муки, содержащей от 0 % до 10 % (по массе) ГМ-кукурузы линии
MON 810. которые были приготовлены для этого метода NFRI
[28]
.
(29).
Испытанными образцами были зерна кукурузы, кукурузная крупа, кукурузная мука грубого и тонкого помолов
Проведенные перед совместным испытанием лабораторий тесты на специфичность показали отсутствие пе
рекрестной реактивности детекторной системы со следующими нецелевыми видами/образцами — рисом
(Or
y
za
satJi/a), пшеницей (
T
n
tic
um
a
es
li
vum
)
и ячменем {
H
ord
e
um
vu
lgar
e
)
.
Не наблюдали перекрестной реактивности с
ГМ-соеЙ линии GTS 40-3-2 и со следующими линиями ГМ-кукурузы — Event176. B ill. GA21 и Т25.
С.5.2.4 Оптимизация
Оптимизация реактивов была проведена для СДП ABl PRISM 7700* с использованием набора TaqMan® хи
мия [38).
Расчет праймеров и зондов был проведен с помощью программного обеспечения Primer Express* (Applied
Biosystems).
С.5.2.5 Предел детектирования (LOO)
Абсолютный предел детектирования в соответствии с указаниями разработчика метода — 20 копий плазмид
стандартного материала
[28]
.
Относительный LOD. валидироеанный е ходе совместного испытания лабораторий. — 0.5 % кукурузы линии
MON 810.
С.5.2.6 Предел количественного определения (LOQ)
Абсолютный LOQ в соответствии с указаниями разработчика метода — 20 копий плазмид стандартного мате
риала
[28]
.
Относительный LOO. валидироеанный в ходе совместного испытания лабораторий. — 0.5 % кукурузы линии
MON 810.
С.5.3 Адаптация
Специфическая информация отсутствует.
С.5.4 Принцип
Фрагмент последовательности, специфической для конструкции кукурузы линии MON 810. размером 113п. о.
амллифицировали с помощью ПЦР пары праймеров, специфических для MON 810. ЛЦР-продукты измерялись в
ходе каждого цикла ПЦР (в реальном времени) с помощью олигонуклеотидного зонда, специфического дпя ко
нструкции MON 810. меченного двумя флуоресцентными красителями — РАМ в качестве репортерного красителя и
TAMRA в качестве гасителя. Для этих целей применялся
н
абор
TaqMan* химия.
Фрагмент последовательности таксон-слецифической последовательности
zSSllb
размером 151 п. о. был
амплифицирован с помощью ПЦР в отдельной реакции ПЦР в реальном времени с использованием двух прайме
ров. специфических к
zSSllb
.
и продукты ПЦР измерялись в течение каждого цикла ПЦР с применением зонда, спе
цифического к
zSSllb
.
производства TaqMan*.
Для количественного определения числа копий в экстрагированной ДНК из экстрактов ДНК неизвестного ис
пытательного образца был использован метод калибровочной кривой. Отдельные калибровочные кривые с каждой
системой праймер/зонд генерировались в ходе одного и того же прогона аналитической амплификации. Калибро
вочные кривые составляли из пяти концентраций, включая 20,125.1500,20000. 250000 копий ДНК плазмиды рМи15
[28]
.
В каждой из пяти калибровочных точек проводились трехкратные измерения. Тройные реакции с использова
нием соответствующих разбавлений ДНК. экстрагированной из неизвестного образца, проводились на ABl PRISM®
7700 SDS (Applied Biosystems) в том же самом аналитическом прогоне.
График зависимости значений С, («порогового цикла*), определенных для калибровочных точек в специ
фической для
zSSllb
или целевой последовательности конструкции MON 810. соответственно, от логарифма чис ла
копий ДНК плазмиды pMulS
[28]
использовали для построения капибровочной кривой. Число копий,
определенное для ДНК испытательного образца, получается путем интерполяции из стандартных кривых. Для
определения количества MON 810 в испытательном образце число копий конструкции MON 810 делится на число
копий конструкции
zSSllb
и значение
C
f
.
специфическое для конструкции MON 810, умноженное на 100. какописа но
в разделе С.5.9.
С.5.5 Реактивы
С.5.5.1 Общие положения
Для получения информации о качестве используемых реактивов см.
ГО
С
Т
Р
53214
(подраздел
6
.
6)
.
36