ГОСТ Р 53244— 2008
Т а б л и ц а С
.
14
— Реакционная смесь амплификации в окончательном объеме на одну реакционную
пробирку для целевой таксон-слецифической последовательности 2.е1
Суммарный объем реакции25 мкл
Кодирующая нить ДНК (50 нг геномной ДНК сои)2.5 мкл
Реакционный буфер (включая
ДНК-лолимеразу и дНТФ)
TaqMan© Universal PCR Master Mix (ABI)
12,5 мкл
Праймеры
i.e1n02-5’n Le1n02-3’ (см. таблицу C.13)
См. таблицу
C
.
13
Зонд
Le1-Taq(см.таблицу C.13)
См.таблицу C.13
Т а б л и ц а С.15 — Реакционная смесь амплификации для специфической последовательности GTS 40-3-2
в окончательном объеме в расчете на одну реакционную пробирку
Суммарный реакционный объем25 мкл
Кодирующая нить ДНК (50 нг геномной ДНК сои)2.5 мкл
Реакционный буфер (включая
ДНК полимеразу и дНТФ)
Универсальная смесь для ПЦР
Universal Master Mix (ABI) TaqMan
12.5 мкл
Праймеры
RRS 01-5- и RRS
0 1
-
3
’{см. таблицу C.13)
См. таблицу C.13
Зонд
RRS-Taq (см. таблицу C.13)
См. таблицу C.13
С.4.7.2 Контроли ПЦР
Каждая серия испытаний должна включать все контроли. как это определено в
ГО
С
Т
Р
5
3214
.
Если контроли не дадут ожидаемых результатов, результаты испытаний должны быть забракованы, и анализ
должен быть повторен.
В качестве положительного контроля/стандартного калибровочного материала доступны по крайней мере
две альтернативы, а именно:
- высококачественная чистая геномная ДНК. экстрагированная из соевых бобов, может быть использована,
если количество ДНК известно на основе расчета числа копий целевой последовательности, исходя из размера ге
нома сои;
Ь) плазмида, содержащая целевую <ые) последовательность^), может быть добавлена в различных концен
трациях с известным числом копий. Такая плазмида доступна в наборе GM Soybean (RRS) Detection Plasmid Set
(Fasmac No. PS-2 and Nippon Gene No. 310-04981 (28).
Всоответствии с требованиями обеспечения качества положительные контроли предпочтительно не должны
быть теми же самыми, что и стандартные калибровочные материалы.
С.4.7.3 Температурно-временная программа
Температурно-временная программа, приведенная в таблице С. 16. была оптимизирована для СДП ABI
PRISM6 7700 (Applied Biosystems). В валидационном исследовании он использовался совместно с универсальной
смесью для ПЦР Universal Master Mix (ABI) TaqMan®. Использование других термоциклеров может потребовать спе
циальной адаптации. Время, необходимое для активации/инициации денатурации, зависит от особенностей ис
пользуемой смеси Master Mix.
Т а б л и ц а С.16 — Процедура, условия реакции
Этапы
о
п
р
е
д
е
л
е
ния
Время, с
Температура, ’С
Пред-ПЦР: деконтаминация
120
50
Пред-ПЦР: активация ДНК-полимеразы иденатурация кодирующей нити ДНК
600
95
ПЦР (45 циклов)
Стадия 1
Денатурация153095
Стадия 2
Отжиг и элонгация6059
32