ГОСТ Р 53244— 2008
В.1.7.2 Контроли ПЦР
В качестве положительного контроля и стандартного материала для калибровки могут быть использованы
сертифицированные стандартные материалы GTS 40-3-2 (материалы, содержащие от 0.1
%
до 5% генетически мо
дифицированной сои), производимые IRMM. Geel. Бельгия (серии IRMM-410) [21J.
Следует провести все соответствующие контроли, как это описано е
ГО
С
Т
Р
53214
.
В.1.7.3 Температурно-временная программа
Температурно-временная программа, приведенная в таблице 8.4. была оптимизирована для СДП ABI
PRISM* 7700 (Applied Biosystems). В исследовании по подтверждению достоверности метода ABI PRISM* 7700 ис
пользовался совместно с AmpllTaq Gold*ДНК-полимеразой. Использование других термоциклеров может потребо
вать специальной адаптации. Температура и время, необходимые для активации/инициации денатурации, зависят от
особенностей используемой полимеразы.
Условия реакции приведены в таблице В.4.
Т а б л и ц а В.4 — Процедура: условия реакции
Э
та
пы
о
п
р
е
д
е
л
е
ния
Время, с
Температура. ’С
Пред-ПЦР: деконтаминация
120
50
Пред-ПЦР: активация ДНК-полимеразы и денатурация кодирующей нити ДНК
600
95
ПЦР (45 циклов)
Стадия 1
Денатурация1595
Стадия 2
Отжиг и элонгация6060
В.1.8 Ограничения и интерпретация результатов
Так как некоторые ГМО, а не только соя линии GTS 40-3-2. могут содержать последовательность ДНК
35S-npoMOTOpa. метод пригоден только для количественного определения ДНК сои линии GTS 40-3-2 в отсутствии
ГМО. иных, чем соя GTS 40-3-2. Во всех другихслучаях метод может быть применен только для скрининга и целей
контроля.
Приведенный метод пригоден для измерения соотношения ДНК ЭбЭ-промотора и соевой ДНК в отсутствие
других ГМО и вируса мозаики цветной капусты. Это соотношение отражает количество сои линии GTS 40-3-2 в сое
вом ингредиенте исследуемого пищевого продукта. Содержание 1% сои линии GTS 40-3-2 может быть определено,
если количество соевого ингредиента в исследуемом пищевом продукте превышает 5
%
.
П р и м е ч а н и е — Если обработка пищевого продукта в ходе его приготовления привела кдеградации или
удалению ДНК (например, при получении рафинированного соевого масла или рафинированных соевых лектинов),
описанный метод не дает достоверных результатов.
В.1.9 Калибровка и расчет результатов
После определения порогового
з
н
а
ч
е
ния
(например, от 0.01 до 0.1 нормализованной флуоресценции репор-
терного красителя (R,)) система детектирования последовательностей рассчитывает значения С, (число пороговых
циклов) для каждой ПЦР (метод ддС,). Рассчитывают различия между значениями С, 353-специфического и лек-
тин-специфического образцов (АС,:ввй) и стандартных образцов (ДС| е1). Относительное количество 35S-flHK в об
разце (kv). %. относительно стандартного материала рассчитывают по
форм
ул
е
iv = 2 ^4C,al* АС*с,1-с
ст*
<В1)
где сс, — концентрация стандартного образца.
Альтернативным образом калибровочная кривая рассчитывалась (log [с] относительно С,)системой детекти
рования последовательностей на основе стандартов, состоящих из смесей ГМО известных концентраций генети
чески модифицированной сои линии GTS 40-3-2 (например. 0.1 %; 0.5 %. 1%: 2 % и 5 %) или стандартов, состоящих из
подходящих разбавлений стандартных растворов, полученных из смесей ГМО с определенной концентрацией сои
линии GTS 40-3-2 (например. 5 %) — метод двойной калибровочной кривой. Эта калибровочная кривая приме няется
для определения концентрации сои линии GTS 40-3-2 в неизвестном образце. Поскольку ДНК образца мо жет быть
деградирована вследствие процесса приготовления пищевого продукта или из-за того, что образец может содержать
ингредиенты иные, чем соевые бобы, рассчитанная концентрация GTS 40-3-2 должна быть нормализо вана а
соответствии с количеством амллифицируемой соевой ДНК. присутствующей в образце. Это количество
определяют с помощью ПЦР в реальном времени, специфической для гена соевого лектина, с использованием в
качестве стандартной ДНК смесей ДНК определенной концентрации (например. 100 %. 50 %. 25 %. 10 % и 1 % по
15