ГОСТ Р 53244— 2008
С.2.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности
Были идентифицированы ССМ IRMM-410R из высушенной соевой муки, содержавшей от 0 % до 5 % сои ли
нии GTS 40-3-2. Были протестированы такие коммерческие пищевые материалы, как соевая мука и соевые белко
вые изоляты.
Проведенные перед совместным испытанием лабораторий тесты на специфичность показали отсутствие пе
рекрестной реактивности
д
е
т
е
к
тор
ных
с
и
ст
е
м
к
с
л
е
д
ующий
н
е
ц
е
л
е
в
ы
м в
и
дам/образ
ц
ам:
рису
(Ог
у
га
s
ali
v
a)
,
ржи
(S
e
cal
e
c
e
r
e
al
e
)
.
пшенице
(Triiic
um
a
es
ti
vum
)
.
ячменю (
H
ord
e
um
vu
lgar
e
)
,
просу <
P
at
u
c
um
m
iSiac
e
um
)
.
чечевице (
L
e
n
s
oil
m
a
n
s
)
,
белой фасоли
(
P
h
a
se
ol
u
s
vu
lgari
s
), фасоли-машу (
P
h
a
se
ot
u
s
a
u
r
e
u
s
)
,
желтому люпину (Lupinus luteus). те-
осинте мексиканскому
(Z
ee
m
a
y
s
ss
p
.
m
e
x
tca
n
a)
.
томату (Lycopersicon esculentum), картофелю <
Solati
um
t
u
b
e
ro
s
um
ss
p
.
t
u
b
e
ro
s
um
)
,
сорго (Sorghum vulgare). кукурузе (
Z
e
a
m
a
y
s
)
,
рапсу
(Bra
ss
lca
n
ap
u
s
)
.
овсу
(
Av
e
n
a
s
ali
v
a)
,
полбе
(T
n
bc
um
s
p
e
lta)
.
льну
(
L
i
num
u
s
ita
h
ss
i
mum
)
,
гречихе (
Fagop
y
r
um
es
c
u
l
e
n
t
um
). кунжуту (
S
es
a
mum
s
p
.
)
.
человеку
(
H
o
m
o
s
api
e
n
s
s
api
e
n
s
)
,
лососю
(Sal
m
o
s
aiar)
.
быку (Bos taurus) и
ВасШ
и
а
s
u
bti
h
s.
Более того, не обнаружено пере
крестной реактивности с рапсом линии MS8 х RF3 (SeedLmk) или со следующими ГМ-сортами кукурузы ВМ76. ВМ1,
Т25. MON 810. СВН351. DBT418. GA21.
Аллельная стабильность и стабильность числа копий референсного соевого гена была оценена с использо
ванием по крайней мере восьми сортов сои.
С.2.2.4 Оптимизация
Оптимизация концентраций реактивов была проведена для системы детектирования последовательностей
(СДП) ABI PRISM 7700* и прибора LightCycler* с использованием набора TaqMan* химия (5). Никакой дополнитель
ной оптимизации не производили дпя прибора GeneAmp* 5700, поскольку термоциклер в этом инструменте иденти
чен термоциклеру в ABI PRISM 7700*.
Расчет праймеров и зондов был проведен с помощью программного обеспечения Primer Express*’ (Applied
Blosystems).
C.2.2.S Предел детектирования (LOD)
Предел детектирования в ходе совместного испытания лабораторий не оценивался. Предел детектирования
для ПЦР рассчитывался с помощью измерения серии разбавлений целевой ДНК. В соответствии с указаниями раз
работчика метода было показано, что LOD составлял
пя
ть
копий целевой последовательности (определен с
помощью плазмид).
С.2.2.6 Предел количественного определения (LOQ)
Предел количественного определения был определен путем измерения серии разбавлений целевой ДНК.
В соответствии с рекомендациями разработчика метода предел количественного определения составляет
по крайней мере 50 геномных копий сои линии GTS 40-3-2. Значение 1C см. в (23).
Концентрации, исследованные в совместном испытании лабораторий, приведены в таблицах С.5 и С.6.
П р и м е ч а н и е — Число копий в совместном испытании лабораторий не определялось.
С.2.3 Адаптация
Специфическая информация отсутствует.
С.2.4 Принцип
Фрагмент последовательности, специфической для конструкции сои линии GTS 40-3-2, размером 74 п. о. был
амплифицирован с помощью ПЦР пары праймеров, специфических для сои линии GTS 40-3-2. ПЦР-продукты изме
рялись в ходе каждого цикла ПЦР (в реальном времени) с помощью олигонуклеотидного зонда, специфического для
конструкции сои линии GTS 40-3-2. меченного двумя флуоресцентными красителями — РАМ в качестве репор-
терного красителя и TAMRA в качестве гасителя. Для этих целей применялся
н
абор
TaqMan* химия.
Фрагмент последовательности таксон-специфического гена лектина сои (1е1) размером 74 п. о. был ампли
фицирован с помощью ПЦР в отдельной реакции ПЦР в реальном времени с использованием двух праймеров, спе
цифических к гену соевого лектина /е1. и продукты ПЦР измерялись в течение каждого цикла ПЦР с применением
зонда, специфического к гену
l
e
i
.
производства TaqMan*.
Для количественного определения экстрактов ДНК неизвестного исследовательского образца был использо
ван метод калибровочной кривой.
П р и м е ч а н и е — Перед количественным ПЦР-анализом растворы экстрагированной ДНК были проана
лизированы методом качественной ПЦР на приборе ПЦР в реальном времени. Качественный ПЦР-прогон («кон
трольный прогон») проводился для определения «порогового цикла» (значения Ct) каждого образца, для которого
отсутствует экспериментальный опыт. Путем тестирования двух разных разбавлений экстрагированной нуклеино
вой кислоты (например, разбавлений раствора ДНК 1:10 и 1:40) в ходе контрольного прогона можно обнаружить
возможное присутствие ингибиторов амплификации. Кроме того, можно определить подходящее разбавление экс
тракта нуклеиновых кислот, полученного из испытательного образца, которое попадает в калибровочный диапазон
количественного анализа.
С.2.5 Реактивы
С.2.5.1 Общие положения
Для получения информации о качестве используемых реактивов см.
ГО
С
Т
Р
53214 (
п
одразд
е
л
6.6).
24