ГОСТ Р 53244— 2008
Приложение С
(рекомендуемое)
Методы, специфические для конструкций
С.1 Метод количественного определения содержания сои линии GTS 40-3-2 (специфический для кон
струкции) с использованием ПЦР в реальном времени(метод 1)
С.1.1 Введение
В этом приложении приведен метод специфической амплификации и обнаружения таксон-специфического
гена сои (ген лектина. /е1) и ДНК. происходящей из специфической генной конструкции, присутствующей в генети
чески модифицированной сое линии GTS 40-3-2. Этот метод пригоден для количественного определения количес
тва ДНК. происходящей из генетически модифицированной сои линии GTS 40-3-2. в соевых ингредиентах,
содержащих генетически модифицированную сою линии GTS 40-3-2 (Roundup Ready*).
Ограничения см. в С.1.7.
С.1.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров
С.1.2.1 Общие положения
Метод был оптимизирован для сертифициованных стандартных материалов (ССМ IRMM-410)
[21]
,
состоя
щих из высушенной муки соевых бобов, включающих смеси сои GTS 40-3-2 и обычной сои.
Воспроизводимость приведенных методов была проверена в ходе совместных испытаний лабораторий с ис
пользованием неизвестных образцов (образцы, помеченные как SA— SE. см. таблицу С.1), состоявших из смеси
стандартных материалов, тип которых упомянут выше
[22]
.
Кроме того, были протестированы коммерчески доступ
ные пищевые продукты (23).
Число копий каждой из целевых последовательностей на геном подробно оценено не было
[24]
,
(25).
Метод был опубликован в (26).
С.1.2.2 Совместные испытания лабораторий
Пять неизвестных образцов, содержащих от 0,7 % до 3 % (по массе) высушенной соевой муки из сои линии
GTS 40-3-2, были проанализированы одиннадцатью участниками.
Метод, специфичный для детектирования конструкции GTS 40-3-2. дал относительное стандартное отклоне
ние воспроизводимости в диапазоне от 16 % до 28 % (см. таблицу С.1). В ходе начальных экспериментов совмес
тных испытаний лабораторий было определено, что 1 %-ный соевый ССМ не соответствовал заявленному
з
н
а
ч
е
нию
.
Исследования показали, что различавшиеся стандартные материалы были изготовлены разными спосо
бами в разное время, что и привело к разному уровню деградации ДНК. Участники совместного испытания лабора
торий были поставлены в известность о необходимости в ходе этого совместного испытания применять 2 %-ный
ССМ и разбавлять его для получения раствора 1 %-ной стандартной ДНКдля использования при количественном
определении.
Для экстракции ДНК использовалась процедура, предусмотренная в (26). 200 мг материала образца было ли
зировано в 1см3буфера гуанидингидрохлорид/протеиназа К (0.5 ммоль/дм3; 0.8 мг/см3) при
т
е
м
п
е
рат
у
р
е
56 ‘С в
течение трех ч. После стадии обработки РНКазой 500 мкл очищенного экстракта смешивалось с 1см3 силиконовой
смолы Wizard*, и смола со связанной ДНК возвращалась путем отсасывания через колонку с фильтром Wizard*.
После промывания изопропанолом ДНК элюировали с силиконовой смолы 10 ммоль/дм3Трис-буфером pH 9.0 при
температуре 70 ‘С. Концентрацию ДНКоценивали с помощью измерения оптической плотности при 260 нм и приво
дили к уровню 20 мкг/см3. Для последующего ПЦР-анализа 200 игДНК из каждого образца были проанализированы
в двух независимых реакциях.
Образцы анализировались в двух повторностях.
Поскольку образцы, помеченные SA— SE. представляли собой смеси этих различных стандартов, результа
ты. полученные с помощью этих образцов, не могут быть использованы для оценки истинности предложенного ме
тода ПЦР в реальном времени. Однако эти результаты могут быть использованы для оценки точности этих
методов, в силу чего описанные обстоятельства отражают наихудший вариант, ведущий к недооценке точности
прикладного метода ПЦР в реальном времени (22).
Исключение лабораторий основано на использовании приборов ПЦР в реальном времени и статистическом
расчете «выбросов». Метод был разработан для блочных термоциклеров. Поэтому две лаборатории, использовав
шие системы LightCyclei*’ (Roche Diagnostics), были исключены еще до расчета «выбросов». Причина исключения
определенных приборов для ПЦР состояла в наблюдении, что прикладной метод нуждается в тщательной адапта
ции и оптимизации в том случае, если он проводится на приборе для ПЦР в реальном времени, отличном от того,
который изложен в методе. Оставшиеся лаборатории были, кроме того, проверены на выбросы по Груббсу
[27]
.
Однако не было обнаружено ни одного выброса. Подробности совместного испытания лабораторий приведены в
таблице С.1.
17