ГОСТ Р 53244— 2008
Приложение А
(рекомендуемое)
Метод, специфический для целевого таксона
А.1 Метод определения абсолютного количественного содержания ДНК гена
ad
h
1
из кукурузы (специ
фический для целевого таксона) с использованием метода ПЦР в реальном времени
А.1.1 Введение
В этом приложении описан метод специфической амплификации и количественного определения (вспомога
тельного) гена
ad
h
1
(кодирующего алкогольдегидрогеназу 1) из кукурузы (2еа
m
a
y
s
) для определения содержания
ДНК кукурузы или для обнаружения присутствия/отсутстеия в растворах ДНК. экстрагированной из продуктов,
содержащих кукурузную ДНК. например, из пищевых продуктов, детектируемых количеств ингибиторов ПЦР.
Ограничения см. в А.1.8.
А.1.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров
А.1.2.1 Общие положения
Метод был оптимизирован для ДНК. экстрагированной из чистых размолотых кукурузных зерен, листьев куку
рузы и сертифицированных стандартных материалов (серий IRMМ-411. IRMM-412, IRMM-413 {13). {14)).
Воспроизводимость описанного метода была проверена с помощью совместных испытаний лабораторий с
использованием неизвестных образцов (от U1 до U6). состоящих изДНК кукурузы дикого типа с различным числом
копий соответствующей целевой последовательности (см. А.1.2.2). а также в других совместных испытаниях лабо
раторий в комбинации с методами, специфическими для трансформационных событий ГМ-кукуруэы.
Число копий целевой последовательности на гаплоидный геном должно быть равно
е
д
иниц
е
(14).
Должна быть установлена аллельная стабильность целевой последовательности (14).
А.1.2.2 Совместные испытания лабораторий*
Для построения калибровочной кривой для определения абсолютного количества гаплоидных геномов куку
рузы в неизвестных образцах были использованы шесть образцов (S1— S6)ДНК кукурузы дикого типа (экстрагиро
ванной из материала листьев {1б), содержащей известное абсолютное число копий (183486. 61162, 20387. 6796.
2265 и 755) гаплоидных геномов кукурузы. Абсолютное число копий в известных образцах было определено
путем деления массы ДНК (определенной методом флуориметрического количественного определения
двухцепочечной ДНК производства фирмы PtcoGreen. Molecular Probes. Cat. Number P-7589) на
опубликованное среднее значе ние 1C для геномов кукурузы (2,725 пг) (17).
Шесть образцов (U1— U6) ДНК кукурузы дикого типа (экстрагированной из материала листьев (16)) были ис
пользованы в качестве неизвестных образцов. Ожидаемое число копий в неизвестных образцах было определено
тем же методом, что и в известных образцах.
Результаты подтверждения достоверности метода, полученные в ходе совместных испытаний лабораторий,
суммированы в таблице А.1.
Валидация метода была также проведена в комбинации с методами, специфическими для трансформацион
ных событий для нескольких образцов ГМ-кукурузы. например, для сладкой кукурузы 8И1. Подробности комбини
рованных испытаний (относительного количественного определения) см. в (18) и (19).
Т а б л и ц а А.1 — Данные валидации
Образец
Н
а
и
м
е
н
ова
ни
е
п
о
к
азат
е
ля
U1U2изU4U5U6
Число участвовавших лабораторий1212
12121212
Число лабораторий, имевших возврат
ные результаты1010
10101010
Число неработоспособных (invalid) ла
бораторий11
1111
* Подтверждение достоверности (валидация) метода было проведено в ходе совместных испытаний лабо
раторий. организованных Объединенным исследовательским центром Еврокомиссии (EC-JRC) и Институтом за
щиты здоровья и потребителей (IHCP) в соответствии с Международным протоколом гармонизации (15).
6