ГОСТ Р 53244— 2008
Проведенные перед совместным испытанием лабораторий тесты на специфичность показали отсутствие пе
рекрестной реактивности детекторной системы со следующими нецелевыми видами/образцами — рисом (Oryza
satrva), пшеницей (Triticum aestlvum) и ячменем (Hordeum vuigare). Не наблюдали перекрестной реактивности с
ГМ-соей линии GTS 40-3-2 и со следующими линиями ГМ-кукурузы — MON 810. Event176. ВП1 и GA21.
С.9.2.4 Оптимизация
Оптимизация реактивов была проведена для СДП ABI PRISM 7700» с использованием набора TaqMan*
химия (38).
Расчет праймеров и зондов был произведен с помощью программного обеспечения Pnmer Express* (Applied
Biosystems).
С.9.2.5 Предел детектирования (LOD)
Абсолютный предел детектирования в соответствии с указаниями разработчика метода — 20 копий плазмид
стандартного материала (28].
Относительный LOD. валидированный в ходе совместного испытания лабораторий. — 0.5
%
кукурузы ли
нии Т25.
С.9.2.6 Предел количественного определения (LOQ)
Абсолютный LOO в соответствии с указаниями разработчика метода — 20 копий плазмид стандартного мате
риала (28).
Относительный LOQ. валидированный в ходе совместного испытания лабораторий. — 0.5 % кукурузы линии
T2S.
С.9.3 Адаптация
Специфическая информация отсутствует.
С.9.4 Принцип
Фрагмент последовательности, специфической для конструкции кукурузы линии Т25. размером 149 п. о. ам-
плифицировали с помощью ПЦР пары праймеров, специфических для Т25. ПЦР-продукты измерялись в ходе каж
дого цикла ПЦР (в реальном времени)с помощью олигонуклеотидного зонда, специфическогодля конструкции Т25,
меченного двумя флуоресцентными красителями — РАМ в качестве репортерного красителя и TAMRA в качестве
гасителя. Для этих целей применялся TaqMan* химия.
Фрагмент последовательности таксон-слецифической последовательности
zSSIIb
размером 151 п. о. был
амллифицироввн с помощью ПЦР в отдельной реакции ПЦР в реальном времени с использованием двух прайме
ров. специфических к
zSSIIb
,
и продукты ПЦР измерялись в течение каждого цикла ПЦР с применением зонда, спе
цифического к
zSSIIb
.
производства TaqMan*.
Для количественного определения числа копий в экстрагированной ДНК из экстрактов ДНК неизвестного ис
пытательного образца был использован метод калибровочной кривой. Отдельные калибровочные кривые с каждой
системой праймер’зонд генерировались в ходе одного и того же прогона аналитической амплификации. Калибро
вочные кривые составляли из пяти концентраций, включая 20.125.1500.20000.250000 копий ДНК плазмиды pMulS. В
каждой из пяти калибровочных точек проводились трехкратные измерения. Тройные реакции с использованием
соответствующих разбавлений ДНК. экстрагированной из неизвестного образца, проводились на ABI PRISM® 7700
SDS в том же самом аналитическом прогоне.
График зависимости значений С,, определенных для калибровочных точек в специфической для
zSSIIb
или
целевой последовательности конструкции Т25. соответственно, от логарифма числа копий ДНК плазмиды pMul5
использовали для построения калибровочной кривой. См. также ссылку (28]. Число копий, определенное для ДНК
испытательного образца, получается путем интерполяции из стандартных кривых. Для определения количес тва
Т25 в испытательном образце число копий конструкции Т25 делится на число копий гена
zSSIIb
и значение
C
f
.
специфическое для конструкции Т25. умноженное на 100 для получения результата в процентах, как описано в раз деле
С.9.9.
С.9.5 Реактивы
С.9.5.1 Общие положения
Для получения информации о качестве реактивов, которые могут использоваться, см. ГОС 7
Р
53214 (
п
одраз
д
е
л
6
.
6)
.
С.9.5.2 Вода.
С.9.5.3 TaqMan® Universal Master Mix. 2*.
C.9.5.4 Стандартный материал (плазмида).
Стандартным материалом, использовавшимся для разработки и валидации метода, служила плазмида
pMul5. которая включена в набор плазмид для обнаружения ГМ кукурузы (Fasmac № РМ-2 и Nippon Gene N?
319-04981) (28]. Могут быть использованы и другие стандартные материалы, если они могут продемонстриро вать
такие же или лучшие результаты.
С.9.5.5 Олигонуклеотиды
Последовательности праймеров и зондов для специфических для конструкции линии Т25 и таксон-специфи-
ческих генов кукурузы приведены в таблице
С
.
31
.
48