ГОСТ Р 53244— 2008
0.2.2.6 Предел количественного определения (LOQ)
Абсолютный LOD не был определен в ходе межлабсраторных испытаний. В соответствии с указаниями раз
работчика метода было показано, что абсолютный предел количественного определения составляет 10 копий це
левой последовательности.
Относительный LOD не был определен в ходе межлабораторных испытаний. В соответствии с указаниями
разработчика метода было показано, что относительный предел количественного определения составляет по
крайней мере 0.1 % (равен точке наименьшей концентрации на использовавшейся калибровочной кривой).
0.2.3 Адаптация
Специфическая информация отсутствует.
0.2.4 Принцип
Фрагмент размером 92 п. о. последовательности, специфической для кукурузы линии MON 810. был ампли-
фицирован с помощью ЛЦР. Накопленные ПЦР-продукты измеряли в ходе каждого цикла ПЦР (в реальном време ни)
с помощью специфического для целевой последовательности олигонуклеотидного зонда, меченного двумя
флуоресцентными красителями — FAM в качестве репортерного красителя и TAMRA а качестве гасителя (33).
Для относительной количественной оценки содержания ДНК кукурузы линии MON 810 с помощью специфи
ческой для кукурузы референсной системы амплифицировали фрагмент размером 79 п. о. кукурузного гена
hm
g
,
используя ген-слецифическую комбинацию праймеров и зондов.
0.2.5 Реактивы
D.2.5.1 Общие положения
Для получения информации о качестве реактивов, которые могут использоваться, см.
ГО
С
Т
Р
53214
.
п
одраз
д
е
л
6
.
6)
.
0.2.5.2 Вода.
D.2.5.3 ПЦР-буфер (без MgCl,). 2-.
D.2.5.4 Раствор MgCL,. c(MgCI2) ■ 25 ммоль/дм3.
D.2.5.5 Раствор дНТФ. с(дНТФ) = 2.5 ммоль/ дм* (каждый).
0.2.5.6 Олигонуклеотиды
Характеристики применяемых олигонуклеотидов приведены в таблице D.2.
Т а б л и ц а D.2 — Олигонуклеотиды
Н
а
и
м
е
н
ова
ни
е
п
о
к
азат
е
ля
ДНК-лоспедоватепьность олигонуклеотида
Окончательная
концентрация при
ПЦР
Целевая последовательность референсного гена
ZM1-F
5-TTg дАС ТАд AAA ТСТ СдТ дСТ дА-3’
300 нмоль/дм5
2M1-R
5-дСТ АСА ТАд ддА дСС ТТд ТСС Т-3’
300 нмоль/дм5
Зонд ZM1
5-FAM-CAA ТСС АСА САА АСд САС дСд TA-TAMRA-3-
160 нмоль/дм5
Целевая последовательность ГМО
Mail-F1
5-ТСд ААд дАС дАА ддА СТС ТАА СдТ-3’
300 нмоль/дм5
Malt-R1
5 -дСС ACC ТТС СТТ ТТС САС TAT СТТ-3’
300 нмоль/дм5
Зонд Mail-S2
S-FAM-AAC АТС СТТ ТдС CAT ТдС CCA gC-TAMRA Р-За
180 нмоль/дм5
11 FAM: 6-карбоксифлуоресцеин; TAMRA: 6-карбокситетраметилродамин.
Длина ампликона кукурузы ВИ1 составляет 70 п. о.
Длина ген-специфического ПЦР-лродукта ft/ng-гена составляет 79 п. о.; длина MON 810-специфического
ПЦР-продукта составляет 92 л. о.
D.2.5.7 Термостабильная ДНК-лолимераза
ДНК-лолимераза AmpliTaq Gold*.
0.2.5.8 Урацил-Ы-гликозилаза (необязательно)
0.2.5.9 Реакционная смесь амплификации
Подробности реакционной смеси амплификации приведены в таблице D.3.
0.2.6 Прибор
D.2.6.1 Общие положения
Должен использоваться стандартный лабораторный прибор, если не определено иначе.
54