ГОСТ Р 53244— 2008
С.8.2.3.3 Экспериментальное определение специфичности
Амплификация с праймерами и зондами. приводящая к получению ожидаемых ПЦР-продуктов при исследо
вании с образцами высушенной кукурузной муки, содержавшей от 0 % до 10 % (по массе) ГМ-кукурузы пинии GA21.
которые были приготовлены для этого метода NFRI
[28]
.
[29].
Испытанными образцами были зерна кукурузы, кукурузная крупа, кукурузная мука грубого и тонкого помола.
Проведенные перед совместным испытанием лабораторий тесты на специфичность похазапи отсутствие пе
рекрестной реактивности детекторной системы со следующими нецелевыми видами/образцами — рисом (Oryza
saliva), пшеницей (Triticum aestivum) и ячменем (Hordeum vulgare). Не наблюдапи перекрестной реактивности с ГМ-
соей пинии GTS 40-3-2 и со следующими линиями ГМ-кукурузы — MON 810. Event176. 8111 и Т25.
С.8.2.4 Оптимизация
Оптимизация реактивов была проведена для СДЛ ABl PRISM 7700® с использованием набора TaqMan® хи
мия [38].
Расчет праймеров и зондов был проведен с помощью программного обеспечения Primer Express* (Applied
Biosystems).
С.8.2.5 Предел детектирования (LOO)
Абсолютный предел детектирования в соответствии с указаниями разработчика метода — 20 копий плазмид
стандартного материала
[28]
.
Относительный LOD. валидированный в ходе совместного испытания лабораторий. — 0.1
%
кукурузы линии
GA21.
С.8.2.6 Предел количественного определения (LOQ)
Абсолютный LOQ в соответствии с указаниями разработчика метода — 20 копий плазмид стандартного мате
риала [28].
Относительный LOQ. валидированный в ходе совместного испытания лабораторий. — 0.1 % кукурузы линии
GA21.
С.8.3 Адаптация
Специфическая информация отсутствует.
С.8.4 Принцип
Фрагмент последовательности, специфической для конструкции кукурузы линии GA21. размером 133 п. о.
амппифицировали с помощью ПЦР пары праймеров, специфических для GA21. ПЦР-продукты измерялись в ходе
каждого цикла ПЦР (в реальном времени) с помощью олигонуклеотидного зонда, специфического для конструкции
GA21, меченного двумя флуоресцентными красителями — FAM в качестве репортерного красителя и TAMRA в ка
честве гасителя. Для этих целей применялся
н
абор
TaqMan® химия.
Фрагмент последовательности таксон-специфической последовательности
zSSIIb
размером 151 п. о. был
амплифицирован с помощью ПЦР в отдельной реакции ПЦР в реальном времени с использованием двух прайме
ров. специфических к
zSSIIb
.
и продукты ПЦР измерялись в течение каждого цикла ПЦР с применением зонда, спе
цифического к
zSSIIb
.
производства TaqMan*.
Для количественного определения числа копий в экстрагированной ДНК из экстрактов ДНК неизвестного ис
пытательного образца был использован метод калибровочной кривой. Отдельные калибровочные кривые с каждой
системой праймер/зонд генерировались в ходе одного и того же прогона аналитической амплификации. Калибро
вочные кривые составляли из пяти концентраций, включая 20.125.1500,20000.250000 копий ДНК плазмиды pMulS. В
каждой из пяти калибровочных точек проводились трехкратные измерения. Тройные реакции с использованием
соответствующих разбавлений ДНК. экстрагированной из неизвестного образца, проводились на ABl PRISM® 7700
SDS в том же самом аналитическом прогоне.
График зависимости значений С,, определенных для калибровочных точек в специфической для
zSSIIb
или
целевой последовательности конструкции GA21. соответственно, от логарифма числа копий ДНК плазмиды pMulS
[28]. использовали для построения калибровочной кривой. Число копий, определенное для ДНК испытательного
образца, получается путем интерполяции из стандартных кривых. Для определения количества GA21 в испыта
тельном образце число копий конструкции GA21 делится на число копий гена
zSSIIb
и значение
C
f
.
специфическое
для конструкции GA21. умноженное на 100 для получения результата в процентах, как описано в разделе С.8.9.
С.8.5 Реактивы
С.8.5.1 Общие положения
Для получения информации о качестве реактивов, которые могут использоваться, см.
ГО
С
Т
Р
53214 (
п
одраз
д
е
л
6
.
6)
.
С.8.5.2 Вода.
С.8.5.3 TaqMan® Universal Master Mix. 2>.
C.8.5.4 Стандартный материал (плазмида).
Стандартным материалом, использовавшимся для разработки и валидации метода, служила плазмида
рМи!5 [28]. которая включена в набор плазмид для обнаружения ГМ кукурузы (Fasmac № РМ-2 и Nippon Gene
№ 319-04981) [28]. Могут быть использованы и другие стандартные материалы, если они могут продемонстриро
вать такие же или лучшие результаты.
42