ГОСТ Р 53244— 2008
Приложение В
(рекомендуемое)
Методы скрининга
В.1 Метод скрининга для определения относительного количественного содержания ДНК 35S-npoMO-
тора сои линии GTS 40-3-2 с использованием метода ПЦР в реальном времени
В.1.1 Введение
В этом приложении приведен метод специфической амплификации и обнаружения таксон-специфического
гена сои (ген лектина. /е1)и ДНК ЗБв-промотора. происходящего из вируса мозаики цветной капусты, и для количес
твенного определения содержания ДНК 353-промотора в соевых ингредиентах, содержащих генетически модифи
цированную сою линии GTS 40-3-2 (Roundup Ready*).
Ограничения см. в В.1.8.
В.1.2 Статус подтверждения достоверности и характеристики рабочих параметров
В.1.2.1 Общие положения
Метод был оптимизирован для сертифицированных стандартных материалов (COM IRMM-410)
[21]
,
состоя
щих из высушенной муки соевых бобов, включающих смеси сои GTS 40-3-2 и обычной сои.
Воспроизводимость приведенных методов была проверена а ходе совместных испытаний лабораторий с ис
пользованием неизвестных образцов (образцы, помеченные как SA— SE. см. таблицу В.1). состоявших из смеси
стандартных материалов, тип которых упомянут выше (22). Кроме того, были протестированы коммерчески доступ
ные пищевые продукты
[23]
.
Число копий каждой из целевых последовательностей на геном подробно оценено не было (24). (25).
Метод был опубликован в (26).
В.1.2.2 Совместные испытания лабораторий
Пять неизвестных образцов, содержащих от 0.7 % до 3 % (по массе) высушенной соевой муки из сои
GTS 40-3-2, были проанализированы одиннадцатью участниками.
Метод, специфичный для детектирования Збв-промотора. дал относительное стандартное отклонение
воспроизводимости в диапазоне от 17 % до 34 % (см. таблицу В.1). В ходе начальных экспериментов совместных
испытаний лабораторий было определено, что 1 %-ный соевый ССМ не соответствовал заявленному значению.
Исследования показали, что различавшиеся стандартные материалы были изготовлены разными способами а
разное время, что и привело к разному уровню деградации ДНК. Участники совместного испытания лабораторий
были поставлены в известность о необходимости в ходе этого совместного испытания применять 2 %-ный ССМ и
разбавлять его для получения раствора 1 %-ной стандартной ДНК для использования при количественном опре
делении.
Для экстракции ДНК использовалась процедура, описанная в
[26]
.
200 мг материала образца было лизирова
но в 1см* буфера гуанидингидрохлорид/протеиназа К(0.5 ммоль/дм*; 0.8 мг/см1) при
т
е
м
п
е
рат
у
р
е
56 !С в течение
3 ч. После стадии обработки РНазой 500 мкл очищенного экстракта смешивалось с 1 см* силиконовой смолы
Wizard*, и смола со связанной ДНК возвращалась путем отсасывания через колонку с фильтром Wizard*. После
промывания изопропанолом ДНК элюировали с силиконовой смолы 10 ммоль/дм3; Трис-буфером pH 9.0 при
т
е
м
п
е
рат
у
р
е
70 X . Концентрацию ДНКоценивали с помощью измерения оптической плотности при 260 нм и приводи
ли к уровню 20 мк^см*. Для последующего ПЦР-анализа 200 нгДНК из каждого образца были проанализированы в
двух независимых реакциях.
Образцы анализировались в двух повторностях.
Так как образцы, помеченные SA— SE. представляли собой смеси этих различных стандартов, результаты,
полученные с помощью этих образцов, не могут быть использованы для оценки истинности предложенного метода
ПЦР в реальном времени. Однако эти результаты могут быть использованы для оценки точности этого метода, в
силу чего описанные обстоятельства отражают наихудший вариант, ведущий к недооценке точности прикладного
метода ПЦР в реальном времени (22).
Исключение лабораторий основано на использовании приборов ПЦР в реальном времени и на статисти
ческом расчете «выбросов». Метод был разработан для блочных термоциклеров. Поэтому две лаборатории,
использовавшие системы LlghtCycler*, были исключены еще до расчета «выбросов». Причина исключения
определенных приборов для ПЦР состояла в наблюдении, что прикладной метод нуждается в тщательной
адаптации и оптимизации в том случав, если он проводится на приборе для ПЦР в реальном времени, отличном
от того, который изложен в методе. Оставшиеся лаборатории были, кроме того, проверены на выбросы по Груб-
бсу
[27]
.
Однако не было обнаружено ни одного выброса. Подробности совместного испытания лабораторий
приведены в таблице В.1.
11