ГОСТ Р 53244— 2008
А.1.6 Прибор
А.1.6.1 Общие положения
Следует использовать стандартный лабораторный прибор, если не определено иначе
А.1.6.2 Термоциклер
Отмеченный температурно-временной профиль изначально был оттестирован
п
р
и
п
омо
щи
прибора СДП АВ!
PRISM* 7700 (Applied Biosystems).Допускается использовать другие системы ПЦР в реальном времени после адап
тации реакционных условий.
А.1.6.3 Реакционные пробирки
Реакционные пробирки должны быть подходящими для ПЦР-амплификации в термоциклере реального вре
мени. например. ABI PRISM® 96-Well Opbcal Reaction Plate, или MIcroAmp*’ Optical Caps (восемь крышек на полоску,
плоская) (Applied Blosystems).
Д
о
пу
с
к
а
е
тс
я
п
р
и
м
е
н
е
ни
е
др
у
г
их
ср
е
дств
и
зм
е
р
е
ний
с м
е
тро
л
ог
ич
е
с
к
и
м
и
х
ара
к
т
е
р
и
ст
и
к
ам
и
,
а та
к
ж
е
обор
у
дова
ния
и
р
е
а
к
т
и
вов с т
е
хнич
е
с
к
и
м
и
х
ара
к
т
е
р
и
ст
и
к
ам
и
н
е
ни
ж
е
в
ыш
е
у
к
аза
нных
,
е
с
ли
мож
е
т б
ы
ть
п
о
к
аза
н
о
.
ч
то
их
п
р
и
м
е
н
е
ни
е
п
р
и
вод
и
т
к
т
е
м ж
е
р
е
з
ул
ьтатам
.
А.1.7 Процедура: порядок проведения ПЦР
А.1.7.1 Общие положения
Порядок проведения ПЦР для целевой последовательности референсного гена и для целевой последова
тельности ГМО следует проводить в отдельных пробирках, если иное не указано е соответствующем приложении
для ГМ-слецифических целевых последовательностей.
Метод изложен для суммарного объема реакционной смеси ПЦР 2S мкл с реактивами, список которых приве
ден в таблице А.З.
А.1.7.2 Контроли ПЦР
Если контроли не дают ожидаемого результата, результаты анализа должны быть аннулированы, а сам ана
лиз должен быть повторен.
В качестве положительного контроля и/или стандартного материала для калибровки может быть использова
на высококачественная чистая геномная ДНК. экстрагированная из кукурузы (например. ССМ от JRC. IRMM [16].
Должны быть проведены все соответствующие контроли. как это описано в
ГО
С
Т
Р
S3214
.
А.1.7.3 Температурно-временная программа
Температурно-временная программа, приведенная е таблице А.4. была оптимизирована для СДП ABI
PRISM* 7700 (Applied Biosystems). В исследовании по подтверждению достоверности метода ABI PRISM*
7700
ис
пользовался совместно с AmpliTaq Gold*ДНК-лолимеразой. Использование других термоциклеров может потребо
вать специальной адаптации. Температура и время, необходимые для активации фермента, зависят от
особенностей используемой полимеразы. Условия реакции приведены в таблице А.4.
Т а б л и ц а А.4 — Процедура: условия реакции
Э
та
пы
о
п
р
е
д
е
л
е
ния
Вреым. с
Температура. ’’С
Пред-ПЦР: деконтаминация
120
50
Пред-ЛЦР: активация ДНК-полимеразы и денатурация кодирующей нити
ДНК
600
95
ПЦР (50 циклов)
Стадия 1
Денатурация1595
Стадия 2
Отжиг и элонгация6060
А.1.8 Ограничения и интерпретация результатов
Присутствие ингибиторов ПЦР может оказать сильное влияние на точность оценки числа копий аОЛ1-после
довательности в анализируемых образцах. Поэтому необходимо проверять присутствие или отсутствие детектиру
емого количества ингибиторов ПЦР (см. также ИСО 21571. приложение А, (2)). например, путем проведения серии
разбавлений кодирующей нити ДНК и проверки соответствия между разбавлениями и различиями значений С, (по
рогового цикла), т. е. одной единице С, соответствует удвоение концентрации кодирующей нити ДНК.
Для использования этого метода в комбинации с методом количественного определения происходящей из
ГМО ДНК важно, чтобы абсолютное количество кодирующей нити ДНК (нг) было таким же. как при adrtl-ПЦР, так и
при ГМО-специфической ПЦР. Если это будет не так. то абсолютное число копий, полученное а ходе этих реакций,
не может быть сравнено непосредственно и будет необходимо приведений этих чисел в соответствие В
противном случае относительная концентрация ГМО не может быть рассчитана.
9