ГОСТ Р 53244— 2008
Т а б л и ц а С.33 — Реакционная смесь амплификации для специфической последовательности Т25 в оконча
тельном объеме в расчете на одну реакционную пробирку
Суммарный реакционный объем
25 мкл
Кодирующая нить ДНК (50 нг геномной ДНК кукурузы)
2.5 мкл
Реакционный буфер (вклю Универсальная смесь для ПЦР чая
ДНК-лолимеразу и дНТФ) Universal Master Mix (ABI) TaqMan*
12.5 мкл
Праймеры
T25 1-5"and T25 1-3’(см. таблицу C.3J)
См.таблицу С.31
Зонд
T25-2-Taq (см. таблицу C.31)
См.таблицу С.31
С.9.7.2 Контроля ПЦР
Каждая серия испытаний должна включать все контроля, как это определено в
ГО
С
Т
Р
5
3214
.
Если контроля не дадут ожидаемых результатов, результаты испытаний должны быть забракованы, и анализ
должен быть повторен.
В качестве положительного контроля/стандартного калибровочного материала доступны по крайней мере
две альтернативы, а именно.
а) высококачественная чистая геномная ДНК. экстрагированная из зерен кукурузы, может быть использова
на. если количество ДНК известно на основе расчета числа копий целевой последовательности, исходя из размера
генома кукурузы линии Т25;
б) плазмида, содержащая целевую(ые) последовательность(и). может быть добавлена в различных концен
трациях с известным числом копий. Такая плазмида доступна в наборе ОМ Maize Detection Plasmid Set (Fasmac No.
PS-2 и Nippon Gene No. 310-04981). См. также (28J.
В соответствии с требованиями обеспечения качества положительные контроли предпочтительно не должны
быть теми же самыми, что и стандартные калибровочные материалы.
С.9.7.3 Температурно-временная программа
Температурно-временная программа, приведенная в таблице С.34. была оптимизирована для СДП ABI
PRISM* 7700 (Applied Biosystems). В валидационном исследовании он использовался совместно с универсальной
смесью для ПЦР TaqMan® Universal Master Mix. Использование других термоциклеров может потребовать специ
альной адаптации. Время, необходимое для активации/инициации денатурации, зависит от особенностей исполь
зуемой смеси Master Mix.
Т а б л и ц а С.34 — Условия реакции
Э
та
пы
о
п
р
е
д
е
л
е
ния
Время, с
Температура. ’С
Пред-ПЦР: деконтаминация
120
50
Пред-ПЦР: активация ДНК-лолимеразы иденатурация кодирующей нити ДНК
600
95
ПЦР (40 циклов)
Стадия 1
Денатурация3095
Стадия 2
Отжиг и элонгация6059
С.9.8 Ограничения и интерпретация результатов
Если ГМ-кукуруза, иная, чем кукуруза линии Т25, содержит ту же самую специфическую для конструкции по
следовательность ДНК. метод пригоден только для количественного определения ДНК кукурузы линии Т25 в отсут
ствие ГМО, иных, чем кукуруза линии Т25.
Описанный метод пригоден только для определения соотношения последовательности, специфической для
конструкции линии Т25. и таксон-специфической zSS/to-последовательности кукурузы. Это соотношение отражает
количество T2S в исследуемом образце кукурузы. Этот метод был еалидирован только для зерен кукурузы.
Совместное испытание лабораторий является значимым источником данных для обеспечения оценки по
грешности. Также необходимо идентифицировать любые источники погрешностей, которые не охватываются меж
лабораторными испытаниями, такие как отбор проб и др.. в соответствии с основными международными
договоренностями J39), (40).
50