ГОСТ Р 53244— 2008
С.8.5.5 Олигонуклеотиды
Последовательности праймеров и зондов для специфических для конструкции линии GA21 и таксон-специ-
фических генов кукурузы приведены в таблице С.25.
Т а б л и ц а С.25 — Олигонуклеотиды
Н
а
и
м
е
н
ова
ни
е
о
ли
го
ну
к
п
е
от
и
да
ДНК-последовательность олигонуклеотида
Окончательная
концентрация при
ПЦР
Целевая последовательность таксон-специфического гена
5-СТС CCA АТС СТТ TgA CAT СТд С-3’
500 нмоль/ДМ3
5-ТСд ATT ТСТ СТС ТТд дТд АСА дд-3’
500 нмоль/дм3
SSIlb
1-5’
SSIlb
1-3’
SSIlb
-
Taq
5-FAM-AgC AAA дТС АдА дСд СТд САА ТдС A-TAMRA^*
200 нмолы’дм3
Целевая последовательность ГМО
GA21 3-5’
5-дАА дСС ТСд дСА АСд ТСА-3’
500 нмоль/дм’
GA21 3-3’
5-АТС Сдд ТТд дАА АдС дАС ТТ-3’
500 нмоль/дм3
GA21-2-Taq
5’-FAM-AAg дАТ ССд дТд CAT ддС Cg-TAMRA-3*
200 нмоль/дм3
* FAM: 6-карбоксифлуоресцеин. TAMRA: 6-карбокситетрамвтилродамин.
Длина ПЦР-продукта SSIlb составляет 151 п. о.; длина ПЦР-продукта GA21 составляет 133 п. о.
С.8.6 Прибор
С.8.6.1 Общие положения
Должен использоваться стандартный лабораторный прибор, если не определено иначе.
С.8.6.2 Термоциклер
Отмеченный температурно-временной профиль исходно был оттестирован в ходе совместного испытания
лабораторий с прибором СДП ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems). Допускается использовать другие системы
ПЦР в реальном времени после адаптации условий реакции.
С.8.6.3 Реакционные плашка и микропробирки
Реакционные плашка и микропробирки должны быть подходящими для ПЦР-амплификации в термоциклере,
например. ABI PRISM* 96-Well Optical Reaction Plate или MIcroAmp* Optical Caps (восемь крышек/полоска. плоская)
(Applied Biosystems), соответственно. Допускается использовать идругие реакционные плашки, микрофлаконы или
микропробирки, если они могут продемонстрировать такие же или лучшие результаты.
Д
о
пу
с
к
а
е
тс
я
п
р
и
м
е
н
е
ни
е
др
у
г
их
ср
е
дств
и
зм
е
р
е
ний
с м
е
тро
л
ог
ич
е
с
к
и
м
и
х
ара
к
т
е
р
и
ст
и
к
ам
и
,
а та
к
ж
е
об
ор
у
дова
ния
и
р
е
а
к
т
и
вов с т
е
хнич
е
с
к
и
м
и
х
ара
к
т
е
р
и
ст
и
к
ам
и
н
е
ни
ж
е
в
ыш
е
у
к
аза
нных
,
е
с
ли
мож
е
т б
ы
ть
п
о
к
аза
н
о
.
ч
то
их
п
р
и
м
е
н
е
ни
е
п
р
и
вод
и
т
к
т
е
м ж
е
р
е
з
ул
ьтатам
.
С.8.7 Процедура: порядок проведения ПЦР
С.8.7.1 Общие положения
ПЦР для целевой последовательности таксон-специфического гена
zSSIIb
и для специфической целевой по
следовательности линии GA21
с
л
е
д
у
е
т
проводить в отдельных пробирках. Мультиплексная ПЦР (с использовани ем
различных флуоресцентных меток для зондов) не была протестирована или валидирована.
Метод описан для суммарного объема реакционной смеси ПЦР 25 мкл с реактивами, приведенными в табли
цах С.
26
для
zSSIIb
и С.
27
для GA21.
Т а б л и ц а С. 26 — Реакционная смесь амплификации в окончательном объеме на одну реакционную
пробирку для целевой таксон-специфической последовательности
zSSIIb
Суммарный объем реакции25 мкл
Кодирующая нить ДНК (50 нг геномной ДНК кукурузы)2.5 мкл
Реакционный буфер (включая
ДНК полимеразу и дНТФ)
TaqMan® Universal PCR Master Mix (ABI)
12,5 мкл
Праймеры
zSSIIbl
-
S
’
и
zSSIIb
1-3’ (см. таблицу C.25)
См. таблицу C.25
Зонд
zSSIIb
-
Taq (см. таблицу C.25)
См. таблицу С.25
43