ГОСТ Р ИСО 21571—2014
Такой метод также может использоваться для оценки присутствия растворимых ингибиторов ПЦР в выделенной
ДНК (см. ИСО 24276. ИСО 21569 и ИСО 21570).
Однако меченая ДНК может привести к ложному представлению о степени извлечения ДНК. так
как она может гораздо легче выделяться из продукта, чем целевая ДНК.
5.2.2 Процедуры контроля
Процедуры контроля, подлежащие использованию при проведении анализа, описаны в таблице 1
ИСО 24276. Они должны включать, как минимум, отрицательный и положительный контроли экстраги
рования. а также могут включать контроль окружающей среды.
5.2.3 Контроль чистоты ДНК. Внутренний контроль ПЦР
При отработке нового метода экстрагирования присутствие ингибиторов ПЦР в экстрагированной
ДНК может быть оценено с помощью внесения чужеродной ДНК (внутренний стандарт, см. ИСО 24276,
ИСО 21569 и ИСО 21570). Количество добавленной ДНК не должно превышать максимальный уро
вень. допустимый для применяемой системы ПЦР. и должно содержать установленное число копий
последовательности целевой ДНК. Это число необходимо определять отдельнодля каждой последова
тельности целевой ДНК и указывать как кратное нижнему пределу обнаружения. В идеальном случае
концентрация целевой ДНК в ПЦР при положительном контроле должна соответствовать чувствитель
ности. требуемой для анализа. При использовании в качестве положительного контроля ПЦР высо
коконцентрированной клонированной целевой последовательности ДНК необходимо соблюдать осто
рожность из-за высокой опасности перекрестного загрязнения. По возможности нуклеиновые кислоты
положительного контроля должны максимально соответствовать параметрам нуклеиновых кислот ис
следуемого материала.
5.3 Количественная оценка экстрагированной ДНК
5.3.1 Общие положения
Качество, целостность и количество экстрагированной нуклеиновой кислоты оказывают влия
ние на рабочие характеристики аналитического метода и. следовательно, на полученные аналитиче
ские результаты. Предел обнаружения конкретного метода может, таким образом, зависеть от количе
ства использованных нуклеиновых кислот. Необходимо определить общее количество ДНК. которое
используется в ПЦР. равно как и общее количество ДНК целевого таксона, так как ДНК нецелевого
таксона может повлиять на эффективность ПЦР.
Количественная оценка ДНК помогает:
- при определении эффективности различных методов выделения ДНК для определенного вида
объектов (повторяемость);
- измерении концентрации нуклеиновых кислот перед анализом.
5.3.2 Область применения
Каждый метод количественной оценки должен применяться в пределах его динамического диа
пазона с учетом уровня точности измерения.
5.3.3 Количественные стандарты
Точность методов количественной оценки зависит от стандартов нуклеиновых кислот, используе
мых для калибровки метода.
При использовании метода, чувствительного к размеру и/или качеству фрагментов нуклеиновой
кислоты, должны применяться стандарты нуклеиновой кислоты, которые соответствуют ожидаемым
размеру и/или качеству нуклеиновой кислоты, экстрагированной из пробы.
Используемый контрольный материал (национальный или международный стандартный образец)
должен обеспечивать проявление заявленных характеристик по непрерывной цепи при сравнении со
стандартами национального или международного эталона (см. Руководство ИСО 30).
При применении метода с использованием интеркалирующих (встраивающихся в ДНК) агентов
необходимо применять стандарт ДНК с высокой молекулярной массой, если количественной оценке
подлежит ДНК с высокой молекулярной массой. Соответственно необходимо использовать стандарт
ДНК с низкой молекулярной массой при количественной оценке ДНК с низкой молекулярной массой.
Нуклеиновая кислота с высокой молекулярной массой, как правило, содержит некоторое количество
фрагментов с более низкой молекулярной массой. Это означает, что многие методы количественной
оценки ДНК имеют определенную степень неточности, которую необходимо учитывать при оценке ре
зультатов.
5