ГОСТ РИСО 21571—2014
могут культивироваться как заквасочные культуры. В обоих случаях микроорганизмы собираются и подвергаются
дальнейшей обработке 8 соответствии с А.1.4.7.2 или хранятся при температуре минус 20 "С до начала обработки.
А.1.4.7.2 Выделение ДНК
А.1.4.7.2.1 Мицелий, собранный на фильтре из стекловолокна, дважды промывают буфером для экстра-
гирования’лизиса (А.1.4.5.18), не содержащим SDS. Мицелиальную пленку снимают с фильтра и переносят ее в
микропробирку вместимостью 2 см3 с навинчивающимся колпачком (А.1.4.6.2). содержащую 600 мм3 буфера для
экстрагирования/лизкса (А.1.4.5.18) и 600 мм3 смеси фенол — хлороформ — изоамиловый спирт (А.1.4.5.17) и
наполовину заполненную кондиционированными стеклянными шариками (А.1.4.5.23). Дальнейшая обработка
описана в А.1.4.7.2.3.
А.1.4.7.2.2 С осадками после центрифугирования либо общей микробной популяции, бактерий, мицелия,
дрожжей, либо дрожжеподобных микроорганизмов необходимо выполнить следующие процедуры. Клетки промы
вают один раз 1 см3 буфера для экстрагирования/лизиса (А. 1.4.5.18). не содержащего SDS, центрифугируют при
ускорении от 10000д до 1ЗОООд в течение 10 мин. повторяют по меньшей мере еще один раз. затем повторно рас
творяют в 600 мм3 буфера для экстрагирования/лизиса (А.1.4.5.18) и переносят в микропробирку, содержащую
стеклянные шарики и смесь фенол-хлороформ, как указано в А.1.4.7.2.1.
А.1.4.7.2.3 После стадии А.1.4.7.2.1 или А.1.4.7.2.2 содержихюе микропробирки перемешивают на встряхи-
вателе (А.1.4.6.1) со скоростью не менее 100 встряхиваний/мин в течение 1—2 мин. затем немедленно инкубируют
при температуре 65 ®С в течение от 30 до 120 мин. Центрифугируют при ускорении от 10000 до 13000 д в течение 10
мин. Переносят образовавшийся верхний слой в новую микропробирку.
Вслучав примененияДНКдлядальнейшей количественной ПЦР необходимо выполнитьследующие процеду
ры. После 30 мин инкубирования содержимое михролробирхи центрифугируют при ускорении от ЮОООддо 13000д
в течение 15 мин. Переносят образовавшийся верхний слой в новую микропробирку. Добавляют рибонуклеазу-А
(А. 1.4.5.20) до конечной массовой концентрации 0,001 мг/см3 и инкубируют еще в течение 30—90 мин при темпе
ратуре 65 *С.
Добавляют раствор ацетата калия (А.1.4.5.22) до конечной молярной концентрации 0,3 молы’дм3. Переме
шивают, добавляют 1.2 см3 этилового спирта (А.1.4.5.1) и инкубируют в течение ночи при температуре минус 20 "С
или в течение 1 ч при температуре минус 80 *С. ДНК осахщают центрифугированием при ускорении от ЮОООд до
1ЗОООд в течение 15 мин при температуре минус 4 ’С.
Послецентрифугирования осадокДНК осторожно промывают растворомэтиловогоспирта (А.1.4.5.21). Слива
ют образовавшийся сверху слой на бумагу и высушивают содержимое микропробирки в вакууме. ДНК растворяют в
50— 100 мм3 воды. Допускается длительное (до пяти лет) хранение при температуре минус 20 ®С. На
основании проведенных проверок [13] допускается использование воды вместо буфера ТЕ (А.1.4.5.19).
Полученный раствор является основным раствором ДНК.
А.1.4.8 Перечень примеров
Количество исследованных видов/штаммов указывается в скобках:
Absidia corymbifera (1). Acremonium spp. (2). Aspergillus spp. (119). Candida spp. (7). Cladosporium spp. (2).
Cryptococcus spp. (6). Epidermophyton floccosum (1). Fusarium solani (1). Malbranchea pulcheNa (1). Geotrichum spp. (2),
Microsporum canis (1). PaeciSomyces spp. (2). Penidllium spp. (20). PHyrospomm ovale (1). Rhizopus spp. (2).
Saccharomyces cerevisiae (1). Schizosaccharomycespombe (1). Scopu-lanopsis brevicaulis (1). Tricboderma spp. (124).
Trichophyton spp. (2). Trichosporon spp. (2). Ulocladium botrytis (1). Vertidllium tenervm (1).
A.1.4.9 Эффективность применения метода
Эффективность метода проверялась в отношении грибов [13]. При количественном анализе эффективности
выделения было установлено, что использование дробления с помощью стеклянных шариков было наиболее эф
фективным [18].
А.2 Получение ДНК. применимой для ПЦР. методами экстракции ДНК на основе
поливинилпирролидона(ПВП)
А.2.1 Основной метод на основе ПВП
А.2.1.1 Общие положения
Этот простой, быстрый и дешевый метод [19] пригоден для большой группы продуктов, особенно содержа
щих большие количества полифенольных соединений.
А.2.1.2 Статус валидации
Этот метод был проверен путем внутрилабораторных исследований и применяется для систематического
выделения ДНК во многих лабораториях. Данный метод еще не оценивался путем официальных межлаборатор
ных исследований.
А.2.1.3 Принцип
Метод включает стадию лизиса (термический лизис в присутствии додецилсульфата натрия и высокой кон
центрации ЭДТА) и последующее удаление из водной фазы, содержащей ДНК. загрязняющих примесей, например
полифенольных молекул, полисахаридов, метаболитов и растворимых белков, с помощью ПВП в комбинации с
ацетатом аммония. Последним этапом является осаждение ДНК этанолом, что концентрирует ДНК и очищает ее
от солей (см. [19]—[23]).
16