ГОСТ РИСО 21571—2014
А.5.2.12 Отбор образцов, транспортирование, консервация и хранение
Никаких специальных требований не устанавливается.
А.5.2.13 Приготовление анализируемой пробы
Для экстракции и очистки ДНК используйте протокол, приведенный ниже. Необходима адаптация массы
реактивов и объемов буферов к размеру выбранной анализируемой пробы.
Обычно лецитин или растительные масла, которые не подвергались очистке, могут быть взвешены непо
средственно. Вязкие образцы лецитина перед взвешиванием необходимо предварительно нагреть до 60 "С и
хорошо встряхнуть.
А.5.2.14 Калибровка инструментов
Инструменты должны быть прокалиброваны согласно ИСО/МЭК 17025 [39].
А.5.2.15 Этапы метода
А.5.2.15.1 Общая часть
Для экстракции растворителями материал вязкого образца обрабатывают гексаном и гуанидин тиоциа
натным буфером. Способные помешать дальнейшему анализу вещества удаляют экстракцией хлорофор
мом. а оставшуюся РНК разрушают РНКазой А. ДНК осаждают в присутствии гликогена изопропанолом, затем
промывают раствором этилового спирта и растворяют в воде. Для удаления ингибиторов ПЦР ДНК очищают
гель-фильтрацией.
А.5.2.15.2 Процедура экстракции ДНК
Убедившись, что материал образца является максимально гомогенным и помещают 2.5 г в полипропиле
новую центрифужную пробирку обьемом 50 см3. Процедуру экстракции для «холостого» (контрольного) образца
проводят параллельно.
Добавляют 15 см3 н-гексана и растворяют лецитин. Добавляют 2 см3 гуанидин тиоционатного буфера и
тщательно смешивают раствор (например, в течение 10—20 с, используя миксер). Центрифугируют раствор в
течение 10 мин при 4000 д. Большую часть верхней гексановой фазы удаляют. Нижнюю водную фазу (без осадка)
перемещают в стерильную 2 см3 полипропиленовую реакционную пробирку. Центрифугируют раствор в течение 10
мин при 1000Од. Переносят 1 см3 нижней водной фазы в стерильную 2 см3полипропиленовую реакционную
пробирку. Добавляют 0.5 см3 хлороформа и тщательно перемешивают раствор в течение 2 мин. Центрифуги руют
раствор в течение 10 мин при ЮОООд. Переносят от 500 до 750 мм3 водного супернатанта в новую 1.5 см3
полипропиленовую реакционную пробирку и добавляют 5 мм3 раствора рибонуклеазы-А. (Стадия обработки
рибонуклеаэой-А. проводившаяся при межпаборагорных исследованиях, при отсутствии в ней необходимости
гложет быть пропущена. В этом случае экстракцию можно проводить с этапа добавления гликогена).
Смесь в течение 10 мин выдерживают при комнатной температуре, чтобы гидролизировать любую содер
жащуюся в материале РНК. Добавляют 4 мм3 раствора гликогена и 0.8 обьема изопропилового спирта (отно
сительно используемого обьема надосадочной жидкости в пробирке), осторожно перемешивают получившийся
раствор и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Центрифугируют раствор в течение 10 мин при
не менее чем 12000д. Всю надосадочную жидкость из пробирки сливают и осадок ДНК промывают 500 мм3 этилового
спирта. Центрифугируют раствор в течение 5 мин при не менее чем 12000д. Спирт тщательно сливают. ДНК
высушивают при комнатной температуре или в вакууме. Осадок ДНК растворяют в 50 мм3 буфера для элю
ирования (например, выдерживанием в течение ночи в холодильнике; если не достигнуто полного растворения,
слегка нагревают).
А.5.2.15.3 Очистка ДНК посредством гель-фильтрации
Для дополнительной очистки ДНК применяется готовая к использованию колонка для гвль-фильтрации.
Могут использоваться другие колонки или методы очистки, основанные на иных принципах, если они пригодны
для этой цели и эквивалентным образом применяются.
Смолу в колонке Microspin S300 HR1) ресуспендируют. интенсивно встряхивая на Vortex8’. Завинчивающу
юся крышку приоткрывают, поворачивая на четверть оборота, сломав нижнюю заглушку.
Колонку Microspin S300 HR помещают в полипропиленовую реакционную пробирку на 3 см3. Центрифуги
руют при 770 g в течение 1 мин. Помещают колонку Microspin S300 HR в новую полипропиленовую реакционную
пробирку на 1.5 см3 и удаляют завинчивающуюся крышку. Медленно наносят раствор ДНК (50 мм3) на колонку.
Центрифугируют при 770 g в течение 2 мин. Очищенная ДНК присутствует в элюате. Раствор ДНК должен хра
ниться в холодильнике. Если раствор ДНК хранится одну-две недели, то температура 4 ’С достаточна; для более
длительных периодов хранения необходима температура минус 20 "С.
А.5.2.15.4 Количественная оценка ДНК
Если количество отчищенной ДНК образца достаточно, количественная оценка ДНК может быть проведе
на с использованием УФ-спектрофогометра, как описано в приложении В (раздел В.1). Концентрация ДНК также
может быть оценена флюориметрически по методу PicoGreen dsDfslA [17] с использованием комплекта реактивов
(5.2.11.24). или эквивалентным методом.
Колонки MrcroSpin S-ЗОО HR и набор Quant-iT PicoGreen dsDNA Quantitation Kit являются примерами под
ходящего коммерческого продукта. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандар та
и не означает обязательное использование только этих приборов и реагентов. Могут использоваться эквива
лентные приборы и реагенты, если их применение приводит к тем же результатам.
28