ГОСТ РИСО 21571—2014
А.1.2.5.12 Лизоцим
50000 ед./мг белка (1 ед. будет давать АА4М= 0.001 в минуту при 6.24 ед. pH и температуре 25 "С. используя
суспензию Micrococcuslysodeikticus в качестве субстрата, в 2.6 см3 реакционной смеси придлине оптического пути 1
см).
А.1.2.5.13 Сахароза. С12Н120-,.
А.1.2.5.14 Протеиназа-К. приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.
А.1.2.5.15 Натрия ацетат (C2H30 2Na).
А.1.2.5.16 Уравновешенный фенол
Используют фенол, уравновешенный буферным раствором Трис/HCI (> 7.8 ед. pH) или приготовленный в
соответствии с [5J или рекомендациями изготовителя.
А.1.2.5.17 Смесь хлороформ — изоамиловый спирт
Смешивают 24 обьемные части хлороформа (А. 1.2.5.8) и одну обьемную часть изоамилового спирта
(А. 1.2.5.6).
А.1.2.5.18 Смесь фенол — хлороформ — изоамиловый спирт
Смешивают 25 обьемных частей уравновешенного фенола (А. 1.2.5.16) с 24 объемными частями хлорофор
ма (А.1.2.5.8) и одной объемной частью изоамилового спирта (А. 1.2.5.6).
А.1.2.5.19 Раствор мутанолизина в стерильной воде, содержащий 500 или 5000 ед./см3мутанолизина
Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 *С. избегая многократного
замораживания и оттаивания.
А.1.2.5.20 Раствор лизоцима в стерильной воде концентрацией 10 мг/см3
Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 *С. избегая многократного
замораживания и оттаивания.
А.1.2.5.21 Раствор сахарозы, С ^Н ^О ,,. 400 г/дм3.
А.1.2.5.22 Буферный раствор А. (Трис) = 0.020 моль/дм3, (Na23flTA) = 0.020 моль/дм3. (NaCI) = 0.1 моль/дм3
Доводят значение pH до 8.0 ед. pH. используя НС! или NaOH.
А.1.2.5.23 Буфер для экстрагирования/лизиса, содержащий одну обьемную часть буфера А (А. 1.2.5.22) и
одну обьемную часть раствора сахарозы (А.1.2.5.21).
А.1.2.5.24 Раствор SDS. (SDS) = 250 г/дм3.
А.1.2.5.25 Раствор протеиназы-К концентрацией 20 мг/см3
Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 *С. избегая многократного
замораживания и оттаивания.
А.1.2.5.26 Раствор этилового спирта, С2Н5ОН, 70 %-ный
Следует хранить при температуре и использовать при температуре минус 20 *’С.
А.1.2.5.27 Раствор натрия ацетата. C2H30 2Na концентрацией 3 моль/дм3
Доводят значение pH до 5.2 единиц ледяной уксусной кислотой.
А.1.2.5.28 Буфер ТЕ. (Трис) = 0.010 моль/дм3. (Иа2ЭДТА) = 0.001 моль/дм3
Доводят значение pH до 8.0 ед. pH. используя НО или NaOH.
А.1.2.6 Оборудование
А.1.2.6.1 Инструменты для измельчения пробы (например, скальпель).
А.1.2.6.2 Центрифуга, поддерживающая ускорение, как минимум. 12000д. На некоторых стадиях анализа не
обходимо использовать центрифугу с охлаждением.
А.1.2.6.3 Водяная баня или инкубатор.
А.1.2.6.4 Вакуумная сушилка (при необходимости).
А.1.2.6.5 Смеситель, например. Vortex.
А.1.2.7 Методика
А.1.2.7.1 Общие положения
Сразу после приготовления анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить описан
ную ниже процедуру выделения и очистки ДНК. При изменении размера навески пробы требуется соответственно
масштабировать массу реактивов и объемы буферов.
А.1.2.7.2 Приготовление пробы
Измельчают колбасу, гомогенизируют и добавляют к 200—500 мг гомогената три объема воды (до 1.5 см3).
Выдерживают при комнатной температуре приблизительно 10 мин.
А.1.2.7.3 Методика выделения ДНК
Осторожно переносят 500 мм3 водной фазы (суспензии) в новую пробирку. Центрифугируют в течение 10 мин
при ускорении 12000д.
Надосадочную жидкость отбрасывают и повторно растворяют осадок в 500 мм3 буфера для экстрагирова-
ния/лизиса (А.1.2.5.23).
Добавляют 50 мм3 раствора лизоцима (А. 1.2.5.20). Инкубируют при температуре 37 "С в течение 1 ч. Если
результаты неудовлетворительные, можно добавить к лизоциму 10 ед. мутанолизина (А. 1.2.5.19). Однако перед
систематическим применением необходимо проверить специфичное для продукта воздействие згой добавки.
Добавляют 25 мм3 раствора SDS (А. 1.2.5.24) и 25 мм3раствора протеиназы-К (А.1.2.5.25). затем инкубируют
в течение 10 мин при температуре 60 ’С.
10