ГОСТ Р ИСО 21571—2014
А.2.1.4 Меры безопасности
Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.
А.2.1.5 Реактивы
А.2.1.5.1 Этиловый спирт. С2Н5ОН. 96 %-ный.
Следует хранить и использовать при температуре минус 20 ’С.
А.2.1.5.2 Иэопропанол, СН3СНОНСН3.
А.2.1.5.3 Поливинилпирролидон (ПВП). молекулярная масса М = 360 кДа; характеристическая вязкость (зна
чение К) = 80—1004
А.2.1.5.4 Ледяная уксусная кислота. СН3СООН.
А.2.1.5.5 Соляная кислота. HCI. 37 %-ная.
А.2.1.5.6 Хлорид натрия. NaCI.
А.2.1.5.7 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), CjH^NC^.
А.2.1.5.8 Эгилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (№а2ЭДТА). C10H,4N2O8Na2.
А.2.1.5.9 Додецилсульфат натрия (SDS). C12H250 4SNa.
А.2.1.5.10 Ацетат аммония. C2H30 2NH4.
А.2.1.5.11 Раствор этилового спирта. С2Н5ОН. 70 %-ный.
Следует хранить и использовать при температуре минус 20 ’С.
А.2.1.5.12 Буфердляэкстрагирования. pH = 8.0ед.. (Трис) = 0.2 моль/дм3. <NaCI)=0.250 моль/дм3. (Na^flTA) =
= 0.025 моль/дм3. (SDS) = 50 г/дм3.
Доводят значение pH до 8.0 ед. pH . используя HCI или NaOH.
А.2.1.5.13 Раствор ацетата аммония. (NH4C2H80 2) = 7.5 моль/дм3.
Растворяют в стерильной воде. При необходимости пропускают через фильтр с размером пор 0.22 мкм.
А.2.1.5.14 Буфер ТЕ. (Трис) = 0.010 моль/дм3 (Na23flTA) = 0.001 моль/дм3.
Доводят значение pH до 8.0 ад. pH. используя HCI или NaOH.
А.2.1.6 Оборудование
Необходимо использовать обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.
А.2.1.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение 10000 д.
На некоторых этапах необходимо использовать центрифугу с охлаждением.
А.2.1.6.2 Водяная баня или инкубатор.
А.2.1.6.3 Вакуумная сушилка (при необходимости).
А.2.1.6.4 Сублимационная сушилка (при необходимости).
А.2.1.6.5 Смеситель, например VorteX&.
А.2.1.7 Методика
А.2.1.7.1 Сразу после приготовления навески образца из исследуемого продукта (матрицы) необходимо вы
полнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК. При изменении размера навески образца требуется
соответственно масштабировать массы реактивов и обьемы буферов.
А.2.1.7.2 Методика выделения ДНК
Взвешивают 0.25 г измельченного или жидкого материала в пробирке. Добавляют 1 см3буфера для экстра
гирования (А.2.1.5.12). Перемешивают суспензию при температуре 65 "С в течение 1 ч. охлаждают до комнатной
температуры. Последовательно смешивают суспензию с 60 мг порошка ПВП (А.2.1.5.3) и 0.5 обьема раствора
ацетата аммония (А.2.1.5.13). Инкубируют на льду в течение 30 мин.
Центрифугируют при ускорении ЮОООд в течение 10 мин и переносят надосадочную жидкость в чистую про
бирку. Смешивают верхний слой с одним объемом изопропанола (А.2.1.5.2) и инкубируют при температуре минус 20
"С в течение 30 мин. Центрифугируют при ускорении ЮОООд и температуре 4 "С в течение 10 мин и надосадоч ную
жидкость осторожно отбрасывают.
Промывают осадок ДНК в пробирке после центрифугирования двумя объемами раствора этилового спир
та (А.2.1.5.11). Этот этап является важным для удаления любых солей, которые могут оказывать влияние на по
следующий анализ (например. ПЦР). Надосадочную жидкость осторожно отбрасывают (в случае рыхлого осадка
центрифугируют при ускорении ЮОООд и температуре 4 "С в течение 10 мин). Осадок высушивают и повторно рас
творяют его в 100 мм3 воды или соответствующего буфера, например буфера ТЕ (А.2.1.5.14). Полученный раствор
является основным раствором ДНК.
SIGMA Р-5288 — пример подходящего реактива, имеющегося в продаже. Эга информация приводится
для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает обязательность его применения. Могут исполь
зоваться эквивалентные реактивы, если их применение приводит к тем же результатам.
17