ГОСТ РИСО 21571—2014
А.2.1.8 Перечень примеров
Метод был успешно применен для выделения ДНК11из следующих продуктов: детское печенье11, детское
молоко1), бельгийский паштет, панировка (пшеничная или кукурузная) рыбных палочек, шоколадное пирожное с
орехами1), консервированная кукуруза, брикетированный зерновой концентрат1), сырный крокет, нугат с курицей,
курица, печенье, глазированное шоколадом1), шоколадная паста1), кукурузные хлопья1*, хрустящие овощи, десерт
ный крем1), композиции для вскармливания детей, кукурузное печенье1), кукурузная мука, мясо свежее и подвер
гнутое тепловой обработке (говядина, свинина, курица и индейка), рубленое мясо, мюсли1>. воздушная кукуруза,
сухое молоко, колбаса (реализуемая в ломтиках1) и коктейльные сосиски1)), шницель, побеги сои1), суповые ша
рики. соевый белок в мясных препаратах1), соевый лецитин1), соевые налитки11, соевый крем, соус для спагетти1),
фигурное печенье, соевый творог, вегетарианский рубленый шницель, вафли с шоколадом1), вафли1), йогурт11.
А.З Получение ДНК. применимой для ПЦР, методами экстракции ДНК на основе ЦТАБ
А.3.1 Основной метод на основе ЦТАБ
А.3.1.1 Общие положения
Этот метод применим для экстракции ДНК из растений и из продуктов, полученных из растений, так как он
позволяет удалять полисахариды и полифенольные соединения, которые могут оказывать негативное влияние на
качество выделяемой ДНК. Метод также пригоден и для некоторых других продуктов (см. А.З. 1.8).
А.3.1.2 Статус валидации
Этот метод был проверен путем кольцевого тестирования (см. А.3.1.9).
Этот метод широко используется во многих лабораториях для систематического выделения ДНК.
А.3.1.3 Принцип
Метод включает стадию лизиса (термический лизис в присутствии ЦТАБ) и следующие за ней несколько
стадий для удаления загрязняющих примесей, например полисахаридов и белков [24].
Для некоторых продуктов рекомендуется использовать различные ферменты, как указано в А.3.1.7.
а-амилаза добавляется к буферудля лизиса, чтобы разрушить крахмал в случае продуктов, содержащих амилозу.
Для большинства продуктов необходима обработка образцов протеинаэой-К для удаления бвлков. Как
правило, рекомендуется обработка рибонухлеазой тех продуктов, для которых соосаждекие рибонуклеиновой
кислоты (ло жет создавать трудности для последующего анализа.
Концентрация солей во время проведения стадий выделения — важный параметр для удаления загрязня
ющих примесей. В случае понижения концентрации солей ниже 0.5 моль/дм3 при комнатной температуре и^или
снижения температуры ниже 16 *С будет образовываться осадок— ЦТАБ-нуклеиновая кислота. Очистки от денату
рированных белков и полисахаридов, образующих комплексные соединения с ЦТАБ. можно добиться повышением
концентрации солей (например, путем добавления хлорида натрия), в то время как нуклеиновые кислоты стано
вятся при этом растворимыми. Для дальнейшей очистки нуклеиновых кислот от ЦТАБ и комплексов полисахарид1
белок используется хлороформ.
Окончательно нуклеиновые кислоты очищают путем осаждения изопроланолом и промывки этиловым
спиртокт.
А.3.1.4 Меры безопасности
Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.
А.З. 1.5 Реактивы
А.3.1.5.1 а-амилаза (при необходимости) типа Па, из видов Bacillus, 1500—3000 едУмг белка.
А.3.1.5.2 Хлороформ. СНС13.
А.З. 1.5.3 Этиловый спирт. С2Н5ОН. 96 %-ный.
А.3.1.5.4 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевзя соль (№2ЭДТА). C10H14N2O8Na2.
А.3.1.5.5 Гексадецилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ). С19Н42ВгМ.
А.З. 1.5.6 Соляная кислота. HCI. 37 %-ная.
А.З. 1.5.7 Изопропанол [СН3СН(ОН)СНз].
А.3.1.5.8 Протеиназа-К (при необходимости), приблизительно 20 едУмг лиофилизата.
А.З. 1.5.9 Рибонуклеаза-А, выделенная из бычьей поджелудочной железы, свободная от дезоксирибонуклеа
зы (при необходимости), приблизительно 50 ед./мг лиофилизата.
А.3.1.5.10 Хлорид натрия. NaCI.
А.3.1.5.11 Гидроксид натрия. NaOH.
А.3.1.5.12 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), С
д
Н
ц
ИО
з
.
А.3.1.5.13 Раствор а-амилазы (при необходимости), (а-амилаза) массовой концентрации 10 мг/см3.
Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 ’С. избегая многократного
замораживания и оттаивания.
’) Повторяемость может зависеть от партии продукта и/или технологии его получения. В некоторых случаях
ДНК не может быть обнаружена или она подверглась расщеплению таким образом, что результаты ПЦР оказы
ваются ниже предела обнаружения метода, независимо от используемых праймеров и>’или протоколов ПЦР. Это
может быть причиной низкой воспроизводимости результатов между лабораториями.
18