ГОСТ Р ИСО 21571—2014
В.2.6.16 Буферный расгвор для загрузки пробы (5*). в буферном растворе для электрофореза (В.2.6.14 или
В.2.6.15) с (глицерин) = 50 %. с (бромфеноловый синий) = 2,5 г/дм3 и/ипи с (ксилол цианол) = 2.5 г/дм3.
В.2.6.17 Раствор бромистого этидия, с (EtBr) = 0.5 мг/дм3
Целесообразно хранить раствор бромистого этидия в виде концентрата (например, 10 мг/см3) при темпера
туре 5 ’С в темноте (EtBr чувствителен к свету). Также желательно избегать взвешивания EtBr. Основной раствор
необходимо готовить путем растворения порошка EtBr. уже находящегося в сосуде, соответствующим количеством
воды или применяя предварительно взвешенные таблетки EtBr. Растворение EtBr следует выполнять в месте, за
щищенном от света, перемешивать при комнатной температуре. Обычно это занимает приблизительно 1 ч.
В.2.7 Оборудование
В.2.7.1 Печь микроволновая или кипящая водяная баня.
В.2.7.2 Оборудование для электрофореза в агарозном геле со вспомогательными принадлежностями и ис
точником питания.
В.2.7.3 Ультрафиолетовый трансоблучатель или лампа, предпочтительно с длиной волны 312 нм.
Альтернативно могут использоваться оборудование для колоночной хроматографии нуклеиновых кислот и
соответствующая система обнаружения или другие аналогичные системы.
В.2.7.4 Регистрирующий прибор, например система фотодокументации с пленкой 3000 ASA и УФ-филыром,
соответствующим флуоресценции, излучаемой EtBr.
Альтернативно могут использоваться система видеодокументации с камерой CCD, соответствующий УФ-
фильтр и (при необходимости) программное обеспечение количественного анализа.
В.2.8 Методика
В.2.8.1 Общие положения
Электрофорез в агарозном геле гложет выполняться с применением как буфера ТАЕ, так и буфера ТВЕ. До
пускается использовать один и тот же буфер для растворения агарозы и заполнения ячейки для электрофореза.
В.2.8.2 Приготовление агарозного геля
Гель должен быть не толще 1см.
Концентрация агарозы и ее качество определяют разрешающую способность геля. Для количественного
анализа ДНК с высокой молекулярной массой используются массовые концентрации агарозы от 8 до 10 г/дм3.Для
количественного анализа ДНК с низкой молекулярной массой (например, деградированной или подвергнутой дей
ствию рестрикгззы) используются более высокие концентрации агарозы (до 40 г/дм3) (38).
Взвешивают соответствующее количество агарозы (В.2.6.1) и добавляют ее в буферный раствор для элек
трофореза (В.2.6.14 или В.2.6.15). Кипятят расгвор в микроволновой лечи или водяной бане (В.2.7.1) до полно го
растворения агарозы. Дополняют обьем, потерянный в результате выпаривания, эквивалентным количеством
воды, перемешивают при взбалтывании (следует избегать захвата пузырьков воздуха), охлаждают раствордо тем
пературы приблизительно 60 "С и Выдерживают его при этой температуре до использования. Готовят гелевую
подложку (лотокдля геля) с соответствующей гребенкой для пробы, расположенной в правильном положении. На
ливают раствор агарозы на гелевый лоток и дают возможность гелю загустеть при комнатной температуре (обычно
рекомендуется в течение 1ч).
В.2.8.3 Приготовление пробы ДНК
Смешивают растворы пробы ДНК (например. 5—10 мм3) с приблизительно 20 % (относительно оконча
тельного объема пробы) буфера для загрузки (В.2.6.16) (например, добавляют 2.5 мм3 буфера для загрузки к 10
мм3 пробы ДНК), перемешивают и вносят смесь в лунки (гнезда) для пробы с помощью микропипетки. Если
предполагается, что неизвестные образцы будут очень концентрированными, то необходимо разбавить их перед
загрузкой в гель.
Для определения размера выделенных фрагментов ДНК добавляют буфер для загрузки пробы (В.2.6.16) (в
соотношении 20 % относительно обьема пробы) к соответствующему количеству стандарта молекулярной массы
ДНК (В.2.6.5) и параллельно проводят электрофорез.
Для оценки концентрации неизвестного образца следует анализировать параллельно стандартные образцы
количества ДНК. Такие образцы содержат известные количества стандарта ДНК (В.2.6.4) (в пределах динами
ческой области применения метода, т. е. от 5 до 500 нг). разбавленного водой или буфером для электрофореза
(В.2.6.14 или В.2.6.15). Рекомендуется использовать стандарты количества, содержащие по меньшей мере пять
калибровочных точек (т.е. различные количества ДНК).
В.2.8.4 Проведение электрофореза
Осторожно вынимают гребенкудля образцов из геля. Переносят гель (вместе с лотком) в ячейкудля электро
фореза таким образом, чтобы лунки находились как можно ближе к катоду (отрицательному электроду). Заполняют
ячейку буфером для электрофореза (В.2.6.14 или В.2.6.15). Похрывают гель слоем того же буфера толщиной 2 мм и
загружают анализируемые пробы с помощью микропипетки.
Выполняют электрофорез при комнатной температуре при соответствующем напряжении и энергоемкости
(обычно рекомендуется максимальное неизменное напряжение 5 В/см для расстояния между электродами). В ука
занных условиях ДНК имеет отрицательный заряд, поэтому она мигрирует от катода к аноду. Время электрофореза
зависит от требуемого расстояния миграции, тока, вырабатываемого источником энергии, электроэндоосмоса и
концентрации агарозы в геле.
33