ГОСТ РИСО 21571—2014
Приложение В
(обязательное)
Методы количественной оценки выделенной ДНК
В.1 Основной метод ультрафиолетовой спектрометрии
В.1.1 Общие положения
В настоящем приложении описывается систематический метод определения концентрации ДНК в растворах.
В.1.2 Статус валидации
Настоящий метод был проверен путем кольцевого тестирования, результаты были опубликованы в [35]. На
пример, метод был успешно применен при межлабораторных сличениях по обнаружению ГМО. организованных
Федеральным министерством общественного здравоохранения в Берне и кантональными лабораториями Базеля и
Цюриха (Щвейцария).
В.1.3 Принцип
Нуклеиновые кислоты в растворе поглощают ультрафиолетовый (УФ) свет в диапазоне 210—300 нм с
максимумом поглощения на длине волны 260 нм. Поскольку ДНК. РНК и нуклеотиды имеют максимум поглоще ния
на длине волны 260 нм. то загрязнение растворов ДНК и РНК нуклеотидами не может быть определено УФ-
спектрометрией. По этой причине до определения ДНК необходимо ферментативное удаление РНК во время
выделения ДНК. Также необходимо удалить олигонуклеотиды и нуклеотиды, полученные при гидролизе РНК (на
пример, обработкой диоксидом кремния, как указано в А.4.1.7.2). Если не удалить образованные при обработке
рибонуклеазой олигонуклеотиды и нуклеотиды (например, обработкой диоксидом кремния), это может привести к
завышению содержания ДНК в образце. Кроме того, двухцепочечная ДНК абсорбирует меньше УФ-света по срав
нению с одноцепочечной ДНК. Поскольку доля одноцепочечной ДНК в растворе неизвестна, то, чтобы избежать
завышения содержания ДНК, вся ДНК в испытуемом образце превращается в одноцепочечную форму путем ис
пользования гидроксида натрия в качестве денатурирующего агента. Так как нуклеиновые кислоты не поглощают на
длине волны 320 нм, показание на этой длине волны является информативным для определения фонового
поглощения в результате рассеяния света и присутствия УФ-активных компонентов.
Построение калибровочного графика не является обязательным при условии, что соответствующий мо
лярный коэффициент экстинхции выбран в зависимости от типа исследуемой нуклеиновой кислоты и/или ее
целостности.
Однако необходимо периодически проверять калибровку спектрометра путем измерения концентрации эта
лонных растворов ДНК.
В.1.4 Область применения
Метод применим к концентрациям ДНК в диапазоне от 2 до 50 мкг/см3. Перед количественным анализом
необходимо сделать соответствующие разбавления выделенной ДНК. подлежащей количественному определе
нию, чтобы ее концентрация находилась в линейном диапазоне спектрометрического измерения (оптическая плот
ность — между 0,05 и 1).
П р и м е ч а н и е — Следует учитывать, что остаточные соединения (например, ЦТАБ. оставшийся в резуль
тате процедуры экстрагирования ДНК) могут оказывать негативное влияние на УФ-спектрометрическое обнару
жение на длине волны 260 нм. Это связано с тем. что данные соединения также поглощают на этой длине
волны.
В.1.5 Реактивы
В.1.5.1 Трис(оксиметил) аминометан (Трис) (C4H1,N 03).
В.1.5.2 Гидроксид натрия (NaOH).
В.1.5.3 Соляная кислота, с (HCI) = 37 %-ная.
В.1.5.4 ДНК-носитель, например ДНК1>спермы сельди или вилочковой железы телят.
В.1.5.5 Эталонный раствор ДНК
Основной раствор ДНК массовой концентрации 10 мг/см3 готовят, растворив 100 мг ДНК-носителя (В.1.5.4)
в 10 см3 буфера для разбавления (В. 1.5.7). ДНК растворяется при этой концентрации очень медленно, и конечный
раствор очень вязкий. Затем разбавляют этот приготовленный основной эталонный растворДНК буфером для раз
бавления до требуемой рабочей концентрации (например. 25 мкг/см3).
В.1.5.6 Раствор гидроксида натрия, с (NaOH) = 2 моль/дм3.
В.1.5.7 Буфер для разбавления, с (Трис) = 0,01 моль/дм3.
Доводят значение pH до 9.0 ед. pH, используя НО.
1) Эти продукты имеются в Sigma как D-7290 и D-1501 соответственно. Эта информация приводится для
удобства пользователей настоящего стандарта и не означает обязательное применение данных реактивов. Могут
использоваться эквивалентные реактивы, если их применение приводит к тем же результатам.
30