ГОСТ РИСО 21571—2014
А.1.1.5.19 Буфер ТЕ. Трис = 0.010 моль/дм3 К2ЭДТА = 0.001 моль/дм3.
Доводят значение pH до 8.0 ед. pH. используя HCI или КОН.
А.1.1.5.20 Раствор протеиназы-К в стерильной воде. 20 мг/см3.
Автоклавирование раствора не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 "С. избегать много
кратного замораживания и оттаивания.
А.1.1.5.21 Раствор рибонухлеазы-А, 10 мг/см3 лиофилизата
Следует хранить при температуре минус 20 "С. избегать многократного замораживания и опаивания.
А.1.1.5.22 Раствор этилового спирта, С2Н5ОН. 70 %-ный.
Следует хранить при температуре минус 20 "С.
А.1.1.5.23 Раствор ацетата калия. (С2Н30 2К). 3 моль/дм3
Доводят значение pH до 5.2 ед. pH ледяной уксусной кислотой. Автоклавирование раствора не допускается.
При необходимости пропускают через фильтр с размером пор 0,22 мкм.
А.1.1.6 Оборудование
Используется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.
А.1.1.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение не менее 10000 д. На некоторых стадиях анализа необхо
димо использовать центрифугу с охлаждением.
А.1.1.6.2 Водяная баня или инкубатор с рабочим диапазоном температур от 60 X до 70 "С.
А.1.1.6.3 Вакуумная сушилка (при необходимости).
А.1.1.6.4 Сублимационная сушилка (при необходимости).
А.1.1.6.5 Встряхиватель, например Vortex1).
А.1.1.6.6 Реакционные сосуды, способные выдержать заморозку в жидком азоте.
А.1.1.7 Методика
А.1.1.7.1 Общие положения
Сразу после приготовления анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить описан
ную ниже процедуру выделения и очисти ДНК. При изменении размера анализируемой пробы необходимо соот
ветственно скорректировать массы и объемы реактивов и буферных растворов.
А.1.1.7.2 Методика выделения
Взвешивают 0,25 г анализируемой пробы в микропробирке. Добавляют 1.6 см3 буфера для экстрагирования’’
лизиса (А.1.1.5.18) и в случае необходимости (например, для проб с высоким содержанием белка) 50 мм3раство ра
протеиназы-К (А.1.1.5.20). Инкубируют при температуре от 60 "С до 70 X , обычно в течение от 30 мин до 2 ч (также
возможно инкубирование в течение ночи). Добавляют рибонуклеазу-А (А.1.1.5.21) до конечной массовой
концентрации 0.1 мкг/см3. Центрифугируют при ускорении 5000 д в течение 30 мин. Извлекают образовавшийся
верхний слой (супернатант) и переносят в чистую пробирку. Добавляют к нему один обьем уравновешенного фе нола
(А.1.1.5.15). затем осторожно и тщательно перемешивают. Центрифугируют при ускорении 5000д в течение 15 мин.
переносят верхнюю водную фазу в чистую пробирку. Добавляют к верхнему слою один объем смеси фе нол —
хлороформ — изоамиловый спирт (А.1.1.5.17). затем осторожно и тщательно перемешивают. Центрифуги руют при
ускорении 5000д в течение 15 мин. переносят верхнюю водную фазу в чистую пробирку. В зависимости от состава
анализируемой пробы (продукта) данную процедуру повторяют один или несколько раз до тех пор. пока граница
раздела фаз не станет четкой.
Добавляют к верхнему слою один обьем смеси хлороформ — изоамиловый спирт (А.1.1.5.16). затем осто
рожно и тщательно перемешивают. Центрифугируют при ускорении 5000 g в течение 10 мин и переносят верхнюю
водную фазу в чистую пробирку. Повторяют до тех пор. пока граница раздела фаз не станет четкой. Смешивают
образовавшийся верхний слой с 0.1 объема раствора ацетата калия (А.1.1.5.23) и 2.5 объема 96 %-ного этилового
спирта (А. 1.1.5.1). затем тщательно перемешивают, переворачивая пробирки. Выдерживают в течение по мень
шей мере 5 мин в жидком азоте или 1 ч при температуре минус 80 X . или всю ночь при температуре минус 20 ’С.
Центрифугируют при ускорении ЮОООд (или до 13000д) при температуре 4 "С в течение по меньшей мере 15 мин.
затем осторожно сливают образовавшийся верхний слой.
Тщательно промывают осадок ДНК в пробирке после центрифугирования двумя объемами 70 %-ного рас
твора этилового спирта (А.1.1.5.22). Центрифугируют при ускорении от ЮОООддо 13000д при температуре 4 X в
течение 15 мин. затем осторожно сливают образовавшийся верхний слой. Эта стадия является особенно важной
для удаления осаждающихся солей, которые могут оказать влияние на последующий анализ (например. ПЦР).
Высушивают осадок в пробирке после центрифугирования и повторно растворяют его в 100 мм3
воды или соответствующего буфера, например буфера ТЕ (А.1.1.5.19). Полученный раствор представля
ет собой основной раствор ДНК. Добавляют рибонуклеазу-А (А.1.1.5.21) до конечной массовой концентрации
0.1 мкг/см3.
Vortex — это пример коммерчески доступного оборудования, пригодного для использования с описывае
мым методом. Эта информация приводится исключительнодля информации пользователей настоящего стандарта
и ни при каких условиях не может служить рекомендацией или одобрением конкретного типа оборудования. Допу
скается использование аналогичного оборудования, при условии, что оно позволяет получать такие же результаты.
8