ГОСТ Р ИСО 21571—2014
I Таблица А.6 — Внутрилабораторная проверка достоверности метода выделения ДНК с пятью образцами
I соевого лецитина (л = 5 повторностей экстракций)
Образец
лецитина. №
Среднее количество копий
гема лектина
Стандартное отклонение
повторяемости *г количество копий
Стабильность коэффициента
вариации СУ/. %
1
20464
5367
26
2
3203
620
19
3
2005
306
15
4
6978
331
5
5
14
8
61
Предварительно, до проведения межлабораторной проверки, ДНК была выделена из пяти коммерческих
лецитинов сои и проверена на возможность ингибирования ПЦР. Подготовленная ДНК от каждого образца была
растворена в буфере ТЕ (один обьем ДНК растворяли в четырех объемах ТЕ буфера; один объем ДНК перво го
разбавления растворяли в четырех объемах ТЕ; один объем ДНК второго разбавления растворяли в четы рех
объемах ТЕ). Различие между (предполагаемым) расчетным С,-значением неразбавленного образца ДНК, и
измеренным С,-значением каждого разбавления ДНК. были ниже 0.1. из чего следует, что ДНК свободна от ПЦР-
ингибиторов.
А.5.2.3.4 Совместные межлабораторные испытания
Совместное испытание (исследованиедостоверности) было выполнено в 12лабораториях (45]. Для оценки
использовали пять коммерчески используемых образцов лецитинов сои. Каждая лаборатория получила 15 зако
дированных образцов и стандартную ДНК для калибровки. Образцы были распределены таким образом, чтобы
каждый участник получил три идентичных образца каждого из пяти лецитинов сои. Для каждой лаборатории
было выполнено единственное выделение ДНК из образца. Возвращенные результаты были разделены на пять
различных образцов лецитина для оценки результатов совместного испытания.
Выделенные ДНК были протестированы методом ПЦР в реальном времени при амплификации последова
тельности ДНК гена лектина сои согласно методике ИСО 21570:2005, С.2 (41]. ДНК-стандарт для калибровки был
приготовлен из соевой муки (ERM BF410a,>] при помощи Plant Mini Kit2*(Qiagen. HilderVGermany); в начале вы
деление ДНК производилось с применением ЦТАБ. Концентрацию ДНК оценивали флюориметрически с исполь
зованием методики PicoGreen2*dsDNA (17]. Стандарты ДНК были определены как число копий (ЧК) эквивалентов
гаплоидного генома в мм3.Для удобства вычисления масса гаплоидного генома сои была принята равной 1.13 лг.
Был подготовлен ряд разведений в пределах 50 000 (ЧК)/5 мм3до 80 (ЧК)/5 мм3.Семь лабораторий использовали
оборудование ПЦР в реальном времени производства ABI2>(ABI 7000, 7500. 7700). пять лаборатории использо
вали приборы Light Cycler2*(Roche) со следующими модификациями к протоколу, описанному в ИСО 21570:2005
[41]: конечный объемдля ПЦР составил 20 мм3. QuantiTect Probe PCR Master Mix2* (Qiagen) с праймерами GM1-F и
GM1-R в концентрации 500 наномоль/дм3 каждый и 150 наномолы’дм3 образца GM1. Программа ПЦР в реаль ном
времени состояла из следующих этапов: горячий старт — 900 с 95 "С. 45 циклов: денатурация ДНК — 10 с при 95
"С; отжиг праймеров — 30 с при 60 "С и элонгация — 30 с при 72 "С. Флуоресцентный сигнал включался в цепь ДНК
на этапе элонгации. Температура хранения — 2 "С.
Критерий пригодности метода, а также практический предел обнаружения, LODptac. для генетически моди
фицированной сои был определен в соответствии с ИСО 24276. Значения (в процентах) были вычислены инди
видуально для каждого образца по формуле
LO D pM c^O D ^aH K -IO O .(А.1)
где LOD^
jj
— предел детектирования специфического для события метода ПЦР в реальном времени, использо
вавшегося для количественной оценки, число копий за ПЦР:
cs— количество амплифицируемой ДНК сои в пробе, в копиях за ПЦР. определенное посредством мето
да ПЦР в реальном времени, специфического для референсного гена сои.
1* Пример коммерческого продукта. Эта информация приводится исключительно для удобства пользова
телей настоящего стандарта и не может служить рекомендацией или принуждением к использованию со сторо
ны ИСО. Допускается использование аналогичного продукта, при условии, что он позволяет получать такие же
результаты.
2>Копенка и набор представляют собой пример коммерческих продуктов, подходящих для использования.
Эта информация приводится исключительно для удобства пользователей настоящего стандарта и не может слу
жить рекомендацией или принуждением к использованию со стороны ИСО. Допускается использование
аналогич ного продукта, при условии, что он позволяет получать такие же результаты.
25