ГОСТ Р ИСО 21571—2014
А.1.3.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение не менее 12000д. На некоторых стадиях анализа необхо
димо использовать центрифугу с охлаждением.
А.1.3.6.2 Водяная баня или инкубатор.
А.1.3.6.3 Вакуумная сушилка (при необходимости).
А.1.3.6.4 Смеситель, например. Vortex1®.
А.1.3.7 Методика
А.1.3.7.1 Общие положения
Сразу после приготовления навески анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить
описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК.
При изменении размера пробы требуется соответственно масштабировать массы реактивов и объемы
буферов.
А.1.3.7.2 Методика экстракции ДНК
Йогурт хорошо встряхивают или перемешивают. Переносят 250 мм3 йогурта в пробирку вместимостью 2 см3.
Добавляют 80 мм3раствора цитрата натрия (А.1.3.5.18). Добавляют 150 мм3раствора NaOH (А.1.3.5.19) и хорошо
перемешивают. Центрифугируют при ускорении 12000д в течение 2 мин.
Осадок после центрифугирования должен иметь диаметр не более 0.7 см и занимать объем не болев
100 мм3. В противном случае указанные стадии (добавление 80 мм3 раствора цитрата натрия и 150 мм3 раствора
NaOH) необходимо повторить.
Отбрасывают верхний слой жира и образовавшийся верхний водный слой и осадок после центрифугирова
ния повторно суспендируют в 500 мм3раствора SSC 5* (А. 1.3.5.20). Центрифугируют не менее 2 мин при ускоре
нии приблизительно 12000д. Надосадочную жидкость отбрасывают. Повторно суспендируют осадок после центри
фугирования в 500 мм3 раствора SSC 5*. Центрифугируют в течение 2 мин при ускорении приблизительно
12000д. Надосадочную жидкость отбрасывают.
Осадок после центрифугирования повторно суспендируют в 500 мм3 буфера для эхстрагирования/лизи-
са (А. 1.3.5.28). Добавляют 50 мм3 раствора лизоцима (А. 1.3.5.25). Инкубируют при температуре 37 “С в течение
1 ч. Если результаты неудовлетворительные, к раствору лизоцима гложет быть добавлено 10 ед. мутанолизина (А.
1.3.5.24). Однако перед систематическим применением необходимо проверить воздействие этой добавки для
соответствующего продукта.
Добавляют 25 мм3 раствора SDS (А.1.3.5.29) и 25 мм3 раствора протеиназы-К (А.1.3.5.30). Инкубируют в
течение 10 мин при температуре 60 ’С. Добавляют 500 мм3 смеси фенол — хлороформ — изоамиловый спирт (А.
1.3.5.23) и перемешивают. Центрифугируют в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12000д. Перено сят
верхнюю водную фазу в новую пробирку. Добавляют один объем смеси хлороформ — изоамиловый спирт (А.
1.3.5.22) и перемешивают. Центрифугируют в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12000д.
Переносят верхнюю фазу в новую пробирку. Добавляют 0.1 объема раствора ацетата натрия (А. 1.3.5.32) и
один обьем изопропанола (А.1.3.5.1). Выдерживают при комнатной температуре не менее 30 мин. Центрифугируют
в течение 15 мин при ускорении приблизительно 12000д. Надосадочную жидкость отбрасывают. Тщательно промы
вают осадок после центрифугирования не менее 500 мм3 раствора этилового спирта (А.1.3.5.31). Центрифугируют
смесь в течение 10 мин при ускорении приблизительно 12000д. Эта стадия является очень важной для удаления
осаждающихся солей, которые могут оказывать влияние на последующий анализ (например. ПЦР).
Надосадочную жидкость отбрасывают.
Осадок после центрифугирования высушивают и повторно растворяют его в 100 мм3 воды или соответству
ющего буфера, например буфера ТЕ (А.1.3.5.33). Полученный раствор является основным раствором ДНК.
А.1.3.8 Перечень примеров
См. таблицу А.З.
Т аб лиц а А.З — Перечень продуктов, к которым был успешно применен описанный метод
Успешно проанализиро
ванный продукт
Содержание добавки и т. д.
МикроорганизмСсыпка
Обычный йогурт
0.3 % жира. 3.5 % жира
Streptococcus
(9).
thermophilus
111]
Фруктовые йогурты
1.5 % жира, модифицированный крахмал, лесной орех, же
латин
1.5 % жира. 3.8 % белка, аспартам, ацесульфам. ананас
3.5 % жира, ароматизатор, желатин, персик, кокосовый орех
10 % жира, модифицированный крахмал, лимон, ароматиза
тор, миндаль, пектин, каротин, рибофлавин
Streptococcus
thermophilus
[9]
Обычный йогурт, под
вергнутый термооб
работке
3.5 % жира
Streptococcus
thermophilus
[12]
13