ГОСТ Р ИСО 21571—2014
А.1.1.8 Перечень примеров
Описанный метод был успешно применен для экстрагирования ДНК1’ из следующих продуктов: квашеные
соевые бобы11, обезвоженная люцерна, детское сухое печенье *. детское молоко1*, бактерии и их споры, семена
ячменя. говяжий’’свиной паштет1*, пиво1*, «голубой сыр», шоколадное пирожное с орехами1*, консервированная
кукуруза, семена моркови, брикетированный зерновой концентрат1*, сыр. наггетсы куриные, листья цикория, корки
цикория, печенье, глазированное шоколадом1*, шоколадная паста1*, печенье с корицей11, компоты, кукурузные
хлопья11,дробленый рис. десертный крем1*, высушенные семена гороха, кукурузное печенье, кормовой кукурузный
жмых, кукурузная мука, кукурузный глютеновый корм, семена кукурузы, гранулированный корм из маниоки, мясо в
муке из маниоки, мясо свежее и подвергнутое тепловой обработке1* (говядина, свинина, курица и индейка), мя коть
дыни, семена дыни, рубленое мясо, ингредиенты мюсли, мюсли1*, побеги золотистой фасоли1*, семена овса, клубни
картофеля, кормовой рапсовый жмых, «глупаколца», семена рапса, колбаса (реализуемая в ломтиках1*и
комбинированная11(см. А.1.2 для усовершенствованного метода экстракции ДНК), шницель, суповые шарики, со
евый белок в мясных продуктах1*,соевый лецитин (необработанный коричневый и желтый рафинированный1*), по
беги сом1), соевые напитки, соя. соевый крем, кормовой соевый жмых, соевый творог, соус для спагетти1*, семена
полбы, сахарная свекла (сушеный жом), сахарная свекла (свежие корнеплоды), семена сахарной свеклы, семена
подсолнечника, тофу (японский соевый творог), свежие томаты, томатная паста1*, семена томатов, вегетариан ский
гамбургер, вафли (с шоколадом11и без шоколада1*), пшеничные отруби, пшеничная мука, глютеновый корм из
пшеницы, семена пшеницы, крупка из твердой пшеницы, йогурт1* (см. А.1.3 для усовершенствованного метода
экстрагирования).
А.1.2 Метод на основе фенола^хлороформа. Процедура для заквасочных культур колбас, подвергае
мых ферментации
А.1.2.1 Общие положения
Этот метод предназначен для экстракции суммарной ДНК. включая бактериальную геномную ДНК. изколбас.
Применимость метода для получения ДНК высокого качества, пригодной для специфического обнаружения реком
бинантной ДНК с использованием ПЦР, была продемонстрирована на колбасах, подвергнутых ферментации [6]. а
также на колбасах, подвергнутых ферментации и термической обработке, так называемых «летних колбасах» [7].
Кроме того, было показано, что настоящий метод экстракции пригоден для выделения суммарной ДНК из сливок
специально для обнаружения Staphylococcus aureus в этом пищевом продукте [в]. (Перечень продуктов, для кото
рых применим этот метод, приведен в А. 1.2.8).
А.1.2.2 Статус валидации
Этот метод был проверен при межлабораторном исследовании проб массой 0.4 г (см. А.1.2.9).
А.1.2.3 Принцип метода
Метод заключается в выделении бактериальных клеток из пищевого продукта путем гомогенизации проб
колбас с последующим центрифугированием. Полученный осадок содержит не только бактериальные клетки, но
также и частицы х«яса. Для проведения специфического лизиса бактериальных клеток их оболочки расщепляют,
добавляя лизоцим. Для улучшения расщепления клеточных оболочек молочнокислых бактерий может быть до
бавлен мутанолизин. Полный лизис клеток происходит при добавлении детергента SDS (додецилсульфата натрия) и
лротеиназы-К. а затем несколько раз проводится экстрагирование водной фазы фенолом и>’или хлороформом.
Стадия экстрагирования фенолом,’хлороформом является важной для устранения любой нуклеазной активности
и ингибиторов ПЦР. включая те. которые возникли из пищевого продукта (например гематина). Последним этапом
является осаждение ДНК этиловым спиртом.
А.1.2.4 Меры безопасности
Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.
А.1.2.5 Реактивы
А.1.2.5.1 Изопропанол [СН3СН(ОН)СНз).
А.1.2.5.2 Этиловый спирт. С2Н5ОН, 96 %-ный
Следует хранить и использовать при температуре минус 20 *С.
А.1.2.5.3 Ледяная уксусная кислота. СН3СООН.
А.1.2.5.4 Соляная кислота, HCI, 37 %-ная.
А.1.2.5.5 Натрия гидроксид, NaOH.
А.1.2.5.6 Иэоамиловый спирт [(СН3)2СНСН2СН2ОН)1.
А.1.2.5.7 Фенол, С6Н5ОН.
А.1.2.5.8 Хлороформ. СНС13.
А.1.2.5.9 Трис (оксиметил) аминометан (Трис). C4H,,N03.
А.1.2.5.10 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль. (№ 2ЭДТА), C10H,4N2O8Na2.
А.1.2.5.11 Натрия додецилсульфат (SDS). C)2H250 4SNa.
1* Повторяемость может зависеть от партии продукта имли технологии его получения. В некоторых случаях
ДНК не может быть обнаружена или она подверглась расщеплению таким образом, что результаты ПЦР оказы
ваются ниже предела обнаружения метода независимо от используемых праймеров и/или протоколов ПЦР. Это
может быть причиной низкой воспроизводимости результатов между лабораториями.
9