ГОСТ Р ИСО 21571—2014
А.1.4.5.8 Фенол. С6Н5ОН.
А.1.4.5.9 Хлороформ’ СНС13.
А.1.4.5.10 Трис(оксиметил) аминометан (Трис). C4H1(N03.
А.1.4.5.11 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (№а2ЭДТА), C10H14N2O8Na2.
А.1.4.5.12 Гидроксид калия. КОН.
А.1.4.5.13 Додецилсульфат натрия (SDS). C,2H250 4SNa.
А.1.4.5.14 Рибонуклеаэа-А. выделенная из бычьей поджелудочной железы, свободная от дезоксирибонукле
азы. приблизительно 50 ед./гиг лиофилизата.
А.1.4.5.15 Уравновешенный фенол. > 7.8 ед. pH
Используют фенол (А. 1.4.5.8), приготовленный в соответствии с [5] или (по выбору) полностью уравнове
шенный буфером для экстрагирования (А.1.4.5.18) без SOS или в соответствии с рекомендациями изготовителя.
А.1.4.5.16 Смесь хлороформ — изоамиловый спирт
Смешивают 24 объемные части хлороформа (А. 1.4.5.9) с одной обьемной частью изоамилового спирта
(А. 1.4.5.7).
А.1.4.5.17 Смесь фенол — хлороформ — изоамиловый спирт
Смешивают одну объемную часть насыщенного фенола (А.1.4.5.15) с одной объемной частью смеси хлоро
форм — изоамиловый спирт (А. 1.4.5.16).
А.1.4.5.18 Буфер для экстрагирования/лизиса. (Трис) = 0.050 молы’дм3, ((^ЭДТА) = 0,050 моль/дм3. (SDS) =
30 г/дм3
Доводят значение pH до 8.0 ед. pH. используя HCI или NaOH.
А.1.4.5.19 Буфер ТЕ. (Трис) = 0.010 моль/дм3 (КрДТА) = 0.001 моль/дм3
Доводят значение pH до 8.0 ад. pH. используя HCI или NaOH.
А.1.4.5.20 Раствор рибонуклеазы-А. = 10 мг/см3 лиофилизата.
Следует хранить при температуре минус 20 "С.
А. 1.4.5.21 Раствор этилового спирта. С2Н&ОН. 70 %-ный
Следует хранить и использовать при температуре минус 20 ’С.
А. 1.4.5.22 Раствор ацетата калия. (С2Н30 2К) = 3 моль1,дм3
Доводят значение pH до 5.2 ед. pH ледяной уксусной кислотой. Автоклавирование не допускается. При не
обходимости пропускают через фильтр с размером пор 0,22 мкм.
А.1.4.5.23 Кондиционированные стеклянные шарики
Стеклянные шарики диаметром 0,2—0.5 мм выдерживают в течение ночи в концентрированной серной кис
лоте (А.1.4.5.3). Промывают их стерильной водой, кипятят в растворе КНС03 (А.1.4.5.24). снова промывают сте
рильной водой и высушивают при температуре 80 "С в вакууме [13]. [14].
А.1.4.5.24 Раствор бикарбоната калия. (КНС03) = 50 г/дм3
Используют свежеприготовленный водный раствор.
А.1.4.6 Оборудование
Используется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.
А.1.4.6.1 Встряхиватель для полиэтиленовых микропробирок вместимостью 2 см3с навинчивающимися кол
пачками. Скорость встряхивания — не менее 100 встряхиваний/мин (например, Mini-BeadBeater™1)).
А.1.4.6.2 Микропробирки, полиэтиленовые пробирки вместимостью 2 см3 с кольцевым уплотнением и на
винчивающимися колпачками.
А.1.4.6.3 Устройство для фильтрования, фильтры из стекловолокна диаметром 25 мм.
А.1.4.6.4 Центрифуга с ускорением как минимум 10000 д. с ротором, способным удерживать микропробирки
вместимостью 2 см3.
На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.
А.1.4.6.5 Водяная баня или инкубатор.
А.1.4.6.6 Вакуумная сушилка (при необходимости). Рекомендуется для приготовления стеклянных шариков
(А. 1.4.5.23).
А.1.4.6.7 Смеситель, например. Vortex®.
А.1.4.7 Методика
А.1.4.7.1 Приготовление анализируемой пробы и микробной фракции
Методы выделения микробных фракций, использующие этап обогащения, могут быть приведены в норма
тивных правовых актах по микробиологическому контролю пищевой продукции. Микробная фракция, полученная
после этапа обогащения, может быть использована для выделения ДНК.
Исходя из анализируемой пробы объемом 1—2 см3 выделяют микробиологическую популяцию соответству ющим
образом (см. А.1.3). В качестве альтернативы дрожжи или гифомицеты. выделенные из навески образца.
Mini-BeadBeater — это пример коммерчески доступного оборудования Biospec products, пригодного для
использования с описываемым методом. Эта информация приводится исключительно для информации пользова
телей настоящего стандарта и ни при каких условиях не может служить рекомендацией или одобрением конкрет
ного типа оборудования. Допускается использование аналогичного оборудования, при условии, что оно позволяет
получать такие же результаты.
15