ГОСТ РИСО 21571—2014
А.1.3.9 Эффективность применения метода
Данные по эффективности применения методики, приведенные в таблице А.4. были получены в результате
совместного исследования, выполненного рабочей группой «Разработка методов идентификации пищевых продук
тов. полученных с использованием способов генной инженерии» Комиссии Федерального управления по охране
здоровья Германии для внедрения методов согласно статье 35 закона Германии о пищевых продуктах (11].
При проведении этого исследования две лаборатории не выполнили проверку гибридизацией. Для данного
исследования мутанолизин не использовался.
Таблица А.4 — Данные по эффективности применения метода
Количество участвующих
лабораторий
Количества образцов
йогурта иа лабораторию
Общее количество
образцов
Количество корректно идентифи
цированныхобразцов
20
10
200
200 (99 контрольных образцов
и 101 образец с ГМО)
А.1.4 Метод на основе фенола/хлороформа. Процедура для дрожжей и/или гифомицетов. собранных
с пищевых продуктов
А.1.4.1 Общие положения
Данный метод описывает одноступенчатое выделение и очистку ДНК. пригодной для ПЦР. из дрожжей, гифо
мицетов [13] или выделенных микробных популяций. Метод применим для выделения ДНК из генетически моди
фицированных микроорганизмов в продуктах очень сложного состава (14]. [15]. Метод может использоваться для
выделения общей ДНК из продукта [14], [15] или из микробной фракции, которая непосредственно выделена из
продукта либо собрана из заквасочных культур (колонии на жидких или агаровых средах).
П р и м е ч а н и е — Предварительное выделение микробной фракции из образца для анализа дает наибо
лее достоверные результаты при выделении ДНК.
Общую ДНК из продукта выделяют с помощью альтернативных методов, приведенных в приложении А Од
нако эти методы не гарантируют, что достаточное количество ДНК будет выделено из всех микроорганизмов (осо
бенно из грибов, устойчивых к лизису, или грамотрицательных бактерий). Данный метод может использоваться для
выделения общей ДНК из таких продуктов, как йогурт, молоко или сыр. Однако достоверное хорошее выделение
ДНК обеспечивается только для тонкоизмельченных или размолотых твердых продуктов. В силу этого перед
при менением метода его эффективность необходимо всегда проверять на ДНК основного исследуемого продукта.
А.1.4.2 Статус валидации
Этот метод выделения ДНК был применен и проверен [13] на представителях 25 родов грибов, представля
ющих 325 видов (включая дрожжи, используемые в хлебопекарном производстве или виноделии, и PenicilDa spp.
[16]. используемые производителями голубого сыра), в форме мицелия и спор (среди которых виды, наиболее
устойчивые к лизису, например Aspergillus fumigates и Cryptococcus neoformans). Данный метод был разработан
таким образом, чтобы избежать лабораторного загрязнения и загрязнения между пробами. Такое свойство метода
позволяет применятьего для проведения систематического выделения ДНК и в больших обьемах и применения ее
для ПЦР. При применении метода не было обнаружено изменений качества матрицы ДНК при качественной
ПЦР после долгосрочного хранения при температуре минус 20 “С в течение по крайней мере пяти лет или
вариаций между различными препаратами ДНК из одного и того же организма. Несмотря на то, что качество
выделенной данным методом ДНК подходит для качественной ПЦР. она может подвергаться недостаточному
расщеплению в процессе рестрикционного анализа. Однако для использования ДНК, полученной данным
методом, для коли чественной ПЦР необходимо выполнить процедуру ее дополнительной очистки с
применением другого метода, например такого, который описан в А.4.
А.1.4.3 Принцип метода
Как правило, бактерии, дрожжи или мицелий разрушаются при перемешивании с высокой скоростью в при
сутствии стеклянных шариков в смеси Трис — фенол — хлороформ — ЭДТА — SDS, а затем ДНК осаждается
этиловым спиртом.
А.1.4.4 Меры безопасности
Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.
А.1.4.5 Реактивы
А.1.4.5.1 Этиловый спирт. С2Н5ОН. 96 %-ный
Следует хранить и использовать при температуре минус 20 "С.
А.1.4.5.2 Ледяная уксусная кислота. СН3СООН.
А.1.4.5.3 Серная кислота, H2S04, > 90 %.
А.1.4.5.4 Бикарбонат калия, КНСОэ.
А.1.4.5.5 Ацетат калия. С2Н30 2К.
А.1.4.5.6 Соляная кислота. HCI, 37 %-ная.
А.1.4.5.7 Изоамиловый спирт [(СН3)2СНСН2СН2ОН].
14