ГОСТ Р ИСО 21571—2014
А.5.1.3 Принцип
Метод заключается в термическом и ферментативном лизисе в присутствии додецилсульфата натрия в де
натурирующем буферном растворе гуанидина. В некоторых случаях в зависимости от продукта необходим допол
нительный этап очистки.
Загрязняющие примеси, например липиды и белки, удаляются на стадии экстрагирования хлороформом по
сле лизиса. Следующим этапом является осаждение ДНК изопропанолом.
А.5.1.4 Меры безопасности
Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.
А.5.1.5 Реактивы
А.5.1.5.1 а-амилаза типа Ма. из видов Bacillus, 1500—5000 ед./мг лиофилизата.
А.5.1.5.2 Ледяная уксусная кислота. СН3СООН.
А.5.1.5.3 Хлороформ. СНС13.
А.5.1.5.4 Этиловый спирт <С2Н5ОН), 96 %-ный.
А.5.1.5.5 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (№а2ЭДТА). C,0HuN2OeNa2.
А.5.1.5.6 Гуанидин гидрохлорид. CH5N3-HCI.
А.5.1.5.7 Соляная кислота. HCI, 37 %-ная.
А.5.1.5.8 Иэопропанол [СН3СН(ОН)СНз1.
А.5.1.5.9 Протеиназа-К. приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.
А.5.1.5.10 Рибонуклеаза-А. выделенная из бычьей поджелудочной железы, свободная от дезокси-рибонукле-
азы. приблизительно 50000 ед./мг лиофилизата.
А.5.1.5.11 Хлорид натрия, NaCI.
А.5.1.5.12 Додецилсульфат натрия (SDS). Cl2H250 4SNa.
А.5.1.5.13 Гидроксид натрия. NaOH.
А.5.1.5.14 Трис(оксиметил) аминометан (Трис). C
j
H^NO
j
.
А.5.1.5.15 Раствор а-амилазы в стерильной воде, концентрацией 10 мг/см3
Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 ’С. избегать многократного
замораживания и оттаивания.
А.5.1.5.16 Раствор этилового спирта. С2Н5ОН, 70 %-ный.
А.5.1.5.17 Буфер для экстрагирования. (Трис) = 0.1 моль/дм3. (NaCi) = 0,15 моль/дм3. (Ма2ЭДТА) =
= 0.05 моль/дм3. (SDS) = 10 г/дм3
Доводят значение pH до 8.0 ед. pH. используя HCI или NaOH.
А.5.1.5.18 Раствор гуанидина гидрохлорида (CHSN3-HCI) молярной концентрации 5 моль/дм3
После приготовления раствор автоклавируют (не более 15 мин при температуре 121 "С).
А.5.1.5.19 Раствор протеиназы-К в стерильной воде, массовой концентрации 20 мг/см3
Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 "С. избегая многократного
замораживания и оттаивания.
А.5.1.5.20 Раствор рибонуклеазы-А массовой концентрации 10 мг/см3
Следует хранить в виде аликвот при температуре минус 20 “С.
А.5.1.5.21 Буфер ТЕ. (Трис) = 0,01 моль/дм3. (Na23flTA) = 0.001 моль/дм3
Доводят значение pH до 8.0 ед. pH. используя HCI или NaOH.
А.5.1.6 Оборудование
А.5.1.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение 8000д. На некоторых стадиях анализа необходимо ис
пользовать центрифугу с охлаждением.
А.5.1.6.2 Инкубатор, желательно с устройством для встряхивания (шейкер-инкубатор).
А.5.1.6.3 Смеситель, например. VorteX®.
А.5.1.7 Методика
А.5.1.7.1 Общие положения
Сразу после приготовления навески анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить
описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК.
При изменении размера навески образца требуется соответственно масштабировать массы реактивов и
объемы буферов.
А.5.1.7.2 Методика экстракции ДНК
Взвешивают 200—500 мг измельченного материала в микропробирке. Добавляют 1.6 см3 предварительно
нафетого до температуры 60 "С буфера для экстрагирования (А.5.1.5.17).
Добавляют 10 мм3 раствора рибонуклеазы-А (А.5.1.5.20) и 10 мм3 раствора а-амилазы (А.5.1.5.15) и осто
рожно перемешивают, переворачивая пробирку вручную. Инкубировать в течение 50 мин при температуре 60 *С
при умеренном перемешивании. Добавляют 1/10 объема раствора гуанидина гидрохлорида (А.5.1.5.18). тщатель но
перемешивают с помощью смесителя (А.5.1.6.3).
Добавляют 20 мм3 раствора протеиназы-К (А.5.1.5.19). плавно перемешивают, переворачивая пробирку
вручную, и инкубируют не менее 2 ч при температуре 60 ’С при умеренном перемешивании. Пробирки оставляют на
лабораторном столе на 15 мин, затем центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 8000д.
23