ГОСТ РИСО 21571—2014
применять для количественного определения ДНК в том случав, если она подверглась деградации. В этом случае
следует применятьдругие методы.
В.2.2 Статус валидации
Этот метод на протяжении многих лет широко применялся при различных исследованиях, однако никогда не
проверялся при межлабораторных исследованиях по обнаружению ГМО в пищевых продуктах.
В.2.3 Принцип
ДНК загружается на молекулярное сито (агарозный гель) и подвергается воздействию электрического поля
в присутствии буферного раствора (37]. С помощью электрофореза ДНК разделяется в зависимости от ее заряда
и молекулярной массы.
Е1Вг встраивается (интеркалирует) в ДНК и при возбуждении ультрафиолетовым светом излучает оранжевую
флуоресценцию. Поскольку значение флуоресценции пропорционально общей массе ДНК. то количество ДНК 8
образце можно оценить путем сравнения флуоресценции, излучаемой неизвестным образцом, с флуоресценцией,
излучаемой набором эталонных растворов ДНК с известным количеством ДНК. Молекулярная масса таких стан
дартов должна быть аналогична молекулярной массе ДНК. подлежащей количественному анализу, так как встраи
вание EtBr в ДНК и возникающее в результате него излучение флуоресценции также зависят от длины фрагментов
ДНК. EtBr также окрашивает одноцепочечную ДНК и РНК. Для более точной оценки содержания ДНК необходимо с
помощью ферментов удалить одноцепочечную ДНК и РНК.
В.2.4 Область применения
Метод применим к концентрациям ДНК в приблизительном диапазоне от 5 до 500 нг при использовании
систем регистрации фотоизображений. Системы видеадокументации с камерой CCD могут обеспечить более вы
сокую чувствительность.
В.2.5 Меры безопасности
Поскольку EtBr является мощным мутагеном и канцерогеном, при обращении с ним следует соблюдать меры
предосторожности. Обязательным требованием является использование перчаток. Все растворы и гели, содержа
щие EtBr, перед выбросом и удалением необходимо подвергать дезактивации (см. (36]).
УФ-излучение особенно опасно для сетчатой оболочки глаза. При работе с УФ-излучением всегда необходи
мо надевать защитные очки или защитную маску.
В.2.6 Реактивы
Электрофорез в агарозном геле может выполняться с применением как буфера ТАЕ. так и буфера ТВЕ.
Применение этого метода не требует наличия реактивов степени чистоты, применяемой в молекулярной
микробиологии. Используемые в данном методе растворы обычно не нуждаются в автоклавировании.
В.2.6.1 Агароза, пригодная для электрофореза ДНК и разделения молекул ДНК предполагаемого размера.
В.2.6.2 Борная кислота (Н3В03). только для буферной системы ТВЕ.
В.2.6.3 Бромфеноловый синий (C^HgB^OgSNa) и/или ксилол цианол FF (C25H27N2OeS2Na).
В.2.6.4 Стандарт количества ДНК соответствующей молекулярной массы (линейная ДНК фага Лямбда для
высокомолекулярных масс ДНК и подвергшаяся рестрикции низкомолекулярная ДНК фага Лямбда для низкомоле
кулярных масс ДНК).
В.2.6.5 Стандарт молекулярной массы ДНК. например коммерческий препарат, содержащий фрагменты ДНК
от очень высокой до очень низкой молекулярной массы.
В.2.6.6 Ледяная уксусная кислота (СН3СООН), только для буферной системы ТАЕ.
В.2.6.7 Эгилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (Иа2ЭДТА) (C10Hu N2O8Na2).
В.2.6.8 Бромистый этидий (EtBr) (C^H^N-jBr).
В.2.6.9 Глицерин (С3Н80 3).
В.2.6.10 Ацетат натрия (C2H30 2Na). только для буферной системы ТАЕ.
В.2 6.11 Соляная кислота, с (HCI) = 37 %-нзя.
В.2.6.12 Гидроксид натрия (NaOH).
В.2.6.13 Трис<оксиметил) аминометан (Трис) (С4Ни Н03).
В.2.6.14 Буферный раствор ТАЕ (1 *), с (Трис) = 0.050 моль/дм3. с (С2Нз02№ ) = 20 моль/дм3, с (Na^flTA) =
= 0.001 моль/дм3.
Доводят значение pH до 8.0 ед. pH ледяной уксусной кислотой или NaOH. Целесообразно готовить буфер
ный раствор ТАЕ в виде концентрированного основного раствора (максимум 50-крагной концентрации). Не следует
использовать буфер при появлении видимого осадка. Разбавление концентрированных буферных растворов для
электрофореза нестерильной, однократно перегнанной или деионизированной водой может выполняться непо
средственно перед их использованием.
В.2.6.15 Трис боратный буферный раствор (ТВЕ) (0.5*), с (Трис) = 0,055 моль/дм3. с (борная кислота) =
= 0.055 моль/дм3. с (№ 2ЭДТА) = 0.001 моль-’дм3
Доводят значение pH до 8.0 ед. pH, используя HCI или NaOH. Целесообразно готовить буферный раствор
ТВЕ в виде концентрированного основного раствора (максимум 10-кратной концентрации. Не следует использо
вать буфер при появлении видимого осадка. Разбавление концентрированных буферных растворов для электро
фореза нестерильной, однократно перегнанной или деионизированной водой гложет выполняться непосредствен
но перед их использованием.
32