ГОСТ РИСО 21571—2014
В случае присутствия в лабораторной пробе солей, специй, сахарной пудры и/или других веществ,
которые потенциально могут оказывать влияние на выделение ДНК или последующий аналитический
метод, должны быть предприняты дополнительные соответствующие процедуры очистки в соответ
ствии с используемым методом (см. приложение А).
Например, в случае образцов сложного состава целевой материал для исследования (например,
панировочный слой рыбных палочек) может быть отделен от остальной части продукта для выделения
ДНК.
5.2 Экстракция и очистка ДНК
5.2.1 Общие положения
При разработке методов выделения ДНК необходимо учитывать следующие требования.
Качество и выход экстрагированной нуклеиновой кислоты при использовании того или иного мето
да для того или иного продукта должны быть как повторяемыми, так и воспроизводимыми при условии
содержания достаточного количества нуклеиновой кислоты в анализируемой пробе, из которой она
была выделена.
Для получения ДНК хорошего качества рекомендуется при необходимости удалить следующие
компоненты:
- полисахариды (пектин, целлюлозу, гемицеллюлозу, крахмал, загустители ит.д.) путем обработки
соответствующим ферментом (например пектиназой, целлюлазой. гемицеллюлазой. а-амилазой) или
экстрагирования органическим растворителем (например гексадецилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ)/
хлороформ);
- рибонуклеиновые кислоты (далее — РНК) и/или белки путем соответствующей обработки, на
пример ферментативной обработки рибонуклеазой и протеиназой соответственно;
- липидные фракции путем ферментативной обработки или использования растворителей (на
пример гексана);
- солей (например из буфера для выделения и лизиса, добавляемых в раствор на стадии осажде
ния), способных оказывать влияние на последующий анализ.
Вчастности, в случае твердых или высушенных проб объем буферадля выделения и лизиса дол
жен быть таким, чтобы гарантировать растворение в нем ДНК.
П р и м е ч а н и е — Очистка ДНК может выполняться различными способами, например путем фракционного
осаждения с использованием таких растворителей, как фенол, хлороформ, этанол, иэолропанол, и/или с использо
ванием адсорбции на твердые матрицы (ионообменную смолу, силикагель или жидкое стекло, диатомовую землю,
мембраны и т. д.). Можно объединить несколько принципов очистки ДНК. При необходимости выделение и очистка
могут совмещаться путем выполнения на одном и том же этапе.
В случае использования соосадителей ДНК, например гликогена, полиэтиленгликоля (ПЭГ),
транспортной РНК (т-РНК), для увеличения выхода ДНК в ходе стадий осахедения они не должны об
ладать нуклеазиой активностью (содержать детектируемый уровень нуклеаз), содержать ингибиторы
и/или конкуренты ПЦР или последовательности нуклеиновых кислот, гомологичные анализируемым
последовательностям. При выделении ДНК из генетически модифицированных растений в качестве
соосадителя может быть использована ДНК-иоситель. например ДНК из спермы лосося или сельди.
При использовании сублимационных сушилок для высушивания осадка ДНК, полученного после
стадии осаждения, необходимо учитывать риск перекрестного загрязнения.
Необходимо повторно растворяют ДНК в воде или буферном растворе для предотвращения де
градации ДНК.
Пример— Для ресуспендирования или разбавленияДНК пригоден трис/ЭДТА (1* или 0,1х)с 8.0 ед. pH.
При применении нового метода выделения ДНК или одного из методов, описанных в приложе
нии А. для новых продуктов потенциальные качество и целостность выделенной ДНК с использованием
выбранного метода должны быть проверены следующим образом, путем добавления влизирующий бу
фер известного количества меченой ДНК вместе с пробой, из которой необходимо выделить ДНК. Если
оценка нового метода производится на основании использования меченой ДНК, количество (масса)
которой известно, или подсчета количества копий определенной последовательности ДНК. необходимо
оценить возможную перекрестную реактивностьтакой ДНК с ДНК. содержащейся в исследуемой пробе.
П р и м е ч а н и е — Использование меченой ДНК является наилучшим приближением к реальной ситуации,
когда предполагается образование комплекса ДНК данного продукта сдругими компонентами (например белками).
4