ГОСТ Р ИСО 21571—2014
В.1.6 Оборудование
В.1.6.1 УФ-спектромвф. допускаются одно-, двулучевые или фотодиодные приборы.
В. 1.6.2 Смеситель, например Vortex.
В. 1.6.3 Сосуды для измерения, например кварцевые или пластмассовые кюветы или пластиковые ячейки
(планшеты), пригодные для УФ-обнаружения на длине волны 260 нм.
Размер используемых сосудов для измерения определяется объемом раствора для измерения: полумикро-
кюветы — 1000 мм3, микрокюветы — 400 мм3, ультрамикрокюветы — 100 мм3, кварцевые капилляры 3—5 мм3.
Оптический путь стандартной кюветы составляет обычно 1 см.
В.1.7 Методика
В. 1.7.1 Измерение эталонного раствора ДНК
Для обеспечения правильной калибровки спектрометр проверяют путем проведения следующих измерений
с использованием эталонного раствора ДНК:
- при измерении фона (контрольного раствора) измерительный сосуд заполняют только буфером для раз
бавления (В. 1.5.7);
- при измерении эталонного раствора измерительный сосуд заполняют эталонным раствором ДНК (В.1.5.5).
Поглощение контрольного раствора и эталонного раствораДНК измеряют для обоих случаев на длинах волн
260 и 320 нм.
В. 1.7.2 Измерение испытуемого раствора ДНК неизвестной концентрации
Для приготовления контрольногораствора смешивают буфердля разбавления(В.1.5.7) сраствором гидрокси
да натрия (В.1.1.5.13) таким образом, чтобы быладостигнута конечная молярная концентрация NaOH 0.2 моль/дм3.
Этой смесью заполняют измерительный сосуд.
Смешивают испытуемый раствор ДНК с раствором гидроксида натрия, чтобы получить конечную концен
трацию NaOH 0,2 моль/дм3 (в случав необходимости смешивают и с буфером для разбавления). Этой смесью
заполняют измерительный сосуд.
Выдерживают как контрольный раствор, так и эталонный раствор ДНК в течение 1мин и проводят измерения
при длинах волн 260 и 320 нм. Показание устойчиво в течение не менее 1 ч.
Пример 1 — Для приготовления контрольного раствора смешивают 90 мкл буфера для разбавле
ния и 10 мкл раствора гидроксида натрия и переносят в измерительный сосуд вместимостью 100 мм3.
Пример 2 — Для приготовления испытуемого раствора ДНК смешивают 80 мм3 буфера для раз
бавления или воды. 10 мм3раствора гидроксида натрия и 10 мм3раствора ДНК неизвестной концен
трации и переносят в измерительный сосуд вместимостью 100 мм3.
В.1.8 Оценка
Для определения фонового значения поглощения (оптической плотности) OD при длине волны 320 нм вы читают
из значения поглощения при длине волны 260 нм. получая исправленное значение поглощения при 260 нм. Если
исправленное значение OD при 260 нм равняется 1,0. то расчетная концентрация ДНК составляет
50 мкг/см3для двухцепочечной ДНК или 37 мкг/см3для одноцепочечной ДНК (например, денатурированной гидрок
сидом натрия) соответственно.
Для получения достоверных измерений значения OD при длине волны 260 нм должны быть более 0,05.
Массовую концентрацию испытуемого раствора двухцепочечной ДНК с учетомденатурации и используемого
коэффициента разбавления рассчитывают по формуле
СДНК = F ’ <О О 260 “ O D 320> ’ 37-
(В.1)
гдеF — коэффициент разбавления:
OD
260 —
поглощение при длине волны 260 нм;
OD
320 —
поглощение при длине волны 320 нм;
3 7 —
переводной коэффициент, мкг/см3.
Пример— Коэффициентразбавления составляет 10. значение ООгес— 0.658и значение OD320— 0,040:
СДНК= 10 ■(0.658 - 0.040) ■37 мкг/см3= 229 мкг/см3.
В.2 Метод электрофореза в агарозном геле и окрашивания бромистым этидием
В.2.1 Общие положения
В настоящем приложении описывается систематический метод определения концентрацииДНК в растворах.
Электрофорез ДНК в агарозном геле и окрашивание бромистым этидием (EtBr) позволяют оценить количество
ДНК и в то же время проанализировать ее физическое состояние (например, степень деградации, присутствие
остаточной РНК и некоторых загрязнителей). Метод также применяется в случаях, если имеется недостаточное
количество ДНК для спектрометрического обнаружения или если ДНК недостаточно очищена и может содержать
вещества, которые поглощают ультрафиолетовое излучение (36]. Электрофорез в геле обычно не рекомендуется
31