ГОСТ Р ИСО 21571—2014
Добавляют один объем смеси фенол — хлороформ — изоамипоеый спирт (А. 1.2.5.18) и перемешивают.
Центрифугируют смесь в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12000д. Переносят верхнюю водную
фазу в новую пробирку.
Добавляют один объем смеси хлороформ — изоамипоеый спирт (А. 1.2.5.17) и перемешивают.
Центрифугируют смесь в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12000д. Переносят верхнюю фазу в
новую пробирку.
Добавляют 0,1 объема раствора ацетата натрия (А.1.2.5.27) и один объем изопропанола (А.1.2.5.1). Осторож
но перемешивают несколько раз путем переворачивания пробирки.
Выдерживают при комнатной температуре не менее 30 мин. Центрифугируют в течение 15 мин при ускоре
нии приблизительно 12000д. Надосадочную жидкость удаляют.
Осадок после центрифугирования тщательно промывают не менее 500 мм3 раствора этилового спирта
(А.1.2.5.26). осторожно перемешивают, несколько раз переворачивая пробирку. Центрифугируют смесь в течение 10
мин при ускорении приблизительно 12000д. Эта стадия является особенно важной для удаления осаждающихся
солей, которые могут оказать влияние на последующий анализ (например. ПЦР).
Надосадочную жидкость отбрасывают.
Осадок после центрифугирования высушивают и повторно растворяют его в 100 мм3 воды или соответству
ющего буфера, например буфера ТЕ (А. 1.2.5.28). Полученный раствор является основным раствором ДНК.
А.1.2.8 Перечень примеров
См. таблицу А.1.
Т аб лиц а А.1 — Перечень продуктов, к которым был успешно применен данный метод
Успешно проанализированный продукт
МикроорганизмСсылка
Колбаса, подвергнутая ферментации
Lactobacillus curvatus
(6)
«Летняя колбаса» (обработанная термически)
Lactobacillus curvatus
[7]
Сливки
Staphylococcus aureus
[8]
А.1.2.9 Эффективность применения метода
Данные по эффективности применения, приведенные в таблицеА.2. были получены в результате совместно
го исследования, выполненного рабочей группой «Разработка методов идентификации пищевых продуктов, полу
ченных с использованием способов генной инженерии» Комиссии Федерального управления по охране здоровья
Германии для внедрения методов согласно статье 35 закона Германии о пищевых продуктах [6].
При проведении этого исследования два образца дали пожноположительные результаты, вызванные, воз
можно. недостатками упаковки. Для данного исследования мутанолизин не использовался.
Т аб лиц а А.2 — Данные эффективности применения метода
Количество участвующих
лабораторий
Количество образцов колбасы
на лабораторию
Общее количество
образцов
Количество корректно
идентифицированных образцов
15
10
150
148
А.1.3 Метод на основе фенола/хлороформа. Процедура для заквасочных культур йогурта
А.1.3.1 Общие положения
Настоящий метод описывает процедуру экстрагирования основной массы ДНК из заквасочных культур, ис
пользуемых для ферментации йогурта из молочных продуктов. Эта методика успешно применяется для обычных
йогуртов, включая йогурты, содержащие различные ингредиенты, такие как фрукты, добавки и стабилизаторы, а
также для продуктов с различным содержанием жира (см. А.1.3.8 и [9)—[11]). Из тЧогуртов. подвергнутых термиче
ской обработке (12), также экстрагируется ДНК. пригодная для ПЦР.
А.1.3.2 Статус валидации
Этот метод был проверен при межлабораторном исследовании (см А.1.3.9).
А.1.3.3 Принцип метода
Этот метод основывается на способе выделения ДНК с помощью фенола/ хлороформа, который адаптиро
ван к специальному пищевому продукту. Грамположительные заквасочные культуры йогуртов концентрируются
после расщепления коагулированного казеина при щелочном pH. Выделенные клетки повторно суспендируют в
буферном водном растворе и обрабатывают лизоцимом (и мутанолизином) для расщепления клеточных оболочек.
Лизис клеток происходит при добавлении ионного детергента, такого как додецилсупьфат натрия (SDS). Белки
удаляют путем обработки протеиназой-К. а затем экстрагируют смесью фенол — хлороформ и хлороформом в
несколько стадий. Последней стадией является осаждение ДНК этиловым спиртом.
А.1.3.4 Меры безопасности
Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.
11