ГОСТ Р ИСО 21571—2014
А.3.1.5.14 Буфер ЦТАБ для экстрагирования. (ЦТАБ) = 20 г/дм3,(№С1) = 1.4 моль/дм3. (Трис) = 0.1 моль/дм3
(Na23flTA) = 0.02 моль/дм3.
Доводят значение pH до 8.0 ед. pH. используя HCI или NaOH.
А.3.1.5.15 Буфер ЦТАБ для осаждения. (ЦТАБ) = 5 г/дм3, (NaCI) = 0.04 моль/дм3.
А.3.1.5.16 Раствор хлорида натрия. (NaCI) молярной концентрации 1.2 моль/дм3.
А.3.1.5.17 Раствор этилового спирта. С2Н5ОН. 70 %-ный.
А.3.1.5.18 Раствор протвиназы-К в стерильной воде (при необходимости), концентрации 20 мг/см3.
Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20 "С. избегая многократного
замораживания и оттаивания.
А.3.1.5.19 Раствор рибонуклеазы-А (при необходимости), массовой концентрации 10 мг/см3.
Следует хранить в виде аликвот при температуре минус 20 "С.
А.3.1.5.20 Буфер ТЕ. (Трис) = 0.01 моль/дм3. с (№ 2ЭДТА) = 0.001 моль/дм3.
Доводят значение pH до 8.0 ед. pH. используя HCI или NaOH.
А.3.1.6 Оборудование
Используется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.
А.3.1.6.1 Инкубатор, желательно с устройством для встряхивания (шейкер-инкубатор).
А.3.1.6.2 Центрифуга, например микроцентрифуга, обеспечивающая ускорение 12000д.
На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.
А.3.1.6.3 Смеситель, например Vortetf8.
А.3.1.6.4 Вакуумная сушилка (при необходимости).
А.3.1.7 Методика
А.3.1.7.1 Общие положения
Сразу после приготовления навески образца из исследуемого продукта необходимо выполнить описанную
ниже процедуру выделения и очистки ДНК.
При изменении размера навески анализируемой пробы требуется соответственно масштабировать массы
реактивов и объемы буферов.
А.3.1.7.2 Экстракция ДНК из анализируемой пробы
Взвешивают 200—300 мг соответствующим образом приготовленного материала в пробирке.
Добавляют 1.5 см3 предварительно нагретого до 65 "С буфера ЦТАБ для экстрагирования (А.3.1.5.14) и
перемешивают (в некоторых случаях может потребоваться большее количество буфера для растворения про
дукта). Добавляют 10 мм3 раствора а-амилазы (А.3.1.5.13. при необходимости). 10 мм3 раствора рибонуклеазы-А
(А.3.1.5.19. при необходимости) и осторожно перемешивают. Инкубируют в течение 30 мин при температуре 65 "С
при перемешивании. Добавляют 10 мм3 раствора протвиназы-К (А.3.1.5.18. при необходимости), аккуратно пере
мешивают содержимое пробирки и инкубируют в течение 30 мин при температуре 65 "С при перемешивании (при
необходимости). Центрифугируют в течение 10 мин при ускорении приблизительно 12000д. Переносят надосадоч-
ную жидкость в новую пробирку, добавляют от 0.7 до одного объема хлороформа (А.3.1.5.2) и тщательно переме
шивают. Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении приблизительно 12000д. Переносят верхнюю (водную)
фазу в новую пробирку.
А.3.1.7.3 ЦТАБ-осаждение
Добавляют два объема буфера ЦТАБ для осаждения (А.3.1.5.15). Инкубируют в течение 60 мин при комнат
ной температуре без перемешивания. Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 12000д. Надосадочную
жидкость отбрасывают. Растворяют осажденную ДНК 350 мм3 раствора NaCI (А.3.1.5.16). Добавляют 350 мм3
хло роформа (А.3.1.5.2) и тщательно перемешивают. Центрифугируют в течение 10 мин при ускорении 12000д.
Пере носят водную фазу в новую пробирку.
П р и м е ч а н и е — ЦТАБ-осаждение является необходимым не для всех продуктов, а только для тех. кото
рые обогащены белками и полисахаридами. При обеспечении получения эквивалентных результатов возможна
очистка ДНК альтернативным методом в твердой фазе (например, при использовании вращающихся колонок).
А.3.1.7.4 Осаждение ДНК
Добавляют 0.6 объема изопропанола (А.3.1.5.7). осторожно перемешивают путем переворачивания пробир
ки и выдерживают ее при комнатной температуре в течение 20 мин. Центрифугируют в течение 15 мин при уско
рении 12000д. Надосадочную жидкость отбрасывают. Добавляют 500 мм3 раствора этилового спирта (А.3.1.5.17) в
пробирку и ее содержимое перемешивают, переворачивая несколько раз. Эта стадия является важной для
обеспе чения полного удаления ЦТАБ. Центрифугируют в течение 10 мин при ускорении 12000д. Надосадочную
жидкость отбрасывают. ОсадокДНК в пробирке после центрифугирования высушивают и повторно растворяют
его в 100 мм3 воды или соответствующего буфера, например буфера ТЕ (А.3.1.5.20). Полученный раствор
является основным раствором ДНК.
А.3.1.8 Перечень примеров
Метод был успешно применен для выделения ДНК из следующих продуктов: порошкообразные продукты
детского питания, продукты детского литания, смеси для хлебопекарного производства, сухое печенье, бульонные
19