ГОСТ Р ИСО 21571—2014
А.4.1.2 Статус валидации
Этот метод прошел внутрилабораторную проверку и используется для систематических анализов во многих
лабораториях. Метод не подвергался оценхе путем официальных межпабораторных исследований. Принцип этого
метода положен в основу множества созданных наборов и тест-систем для экстракции ДНК (см. [29]—{31]).
А.4.1.3 Принцип
Метод состоит из стадии лизиса (термический лизис в присутствии додецилсульфата натрия в буферном
растворе) и последующей стадии очистки с помощью смол из диоксида кремния в присутствии разобщающего
агента, вызывающего диссоциацию комплексов, гуанидина гидрохлорида. Принцип метода состоит в связывания
нуклеиновых кислот диоксидом кремния при низкой водной активности в результате энтропийного эффекта [32].
Загрязняющие примеси вымывают из смолы иэопропанолом. в то время как ДНК остается прикрепленной к адсор
бенту. Во время заключительной стадии элюирования буферным раствором с низким содержанием соли извлека
ется ДНК.
А.4.1.4 Меры безопасности
Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.
А.4.1.5 Реактивы
А.4.1.5.1 Хлорид натрия. NaCI.
А.4.1.5.2 Трис(оксиметип) аминометан (Трис), C4H1,N 03.
А.4.1.5.3 Эгилецдиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (№а2ЭДТА), C,oH,4N2° 8Na2-
А.4.1.5.4 Соляная кислота. HCI. 37 %-ная.
А.4.1.5.5 Гидроксид натрия. NaOH.
А.4.1.5.6 Додецилсульфат натрия (SDS). C12H250 4SNa.
А.4.1.5.7 Протеиназа-К, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.
А.4.1.5.8 Гуанидин гидрохлорид. CH5N3-HCI.
А.4.1.5.9 Хлорид калия. KCI.
А.4.1.5.10 Гидроортофосфат натрия. Na2HP04.
А.4.1.5.11 Дигидроортофосфат калия. КН2Р04.
А.4.1.5.12 Изопропанол (СН3СН(ОН)СНз].
А.4.1.5.13 Диоксид кремнии (Si02), диоксид кремния с гранулометрическим составом от 0.5 до 10 мкм (80 %
частиц от 1до 5 мкм)1).
А.4.1.5.14 Рибонуклеаза-А. свободная от дезоксирибонуклеазы, приблизительно 100 ед./мг лиофилизата.
А.4.1.5.15 Раствор протеиназы-К, концентрацией 20 мг/см3
Растворяют фермент в стерильной воде или буфере, как описано в [34]. Автоклавирование раствора не
допускается. Хранить в виде аликвот при температуре минус 20 ’С. избегать многократного замораживания и
опаивания.
А.4.1.5.16 Раствор I гуанидина гидрохлорида. (CH5N3-HCI) = 5 моль/дм3
Автоклавируют не более 15 мин при температуре 121 ”С.
А.4.1.5.17 Раствор II гуанидина гидрохлорида. (CH5N3-HCI) = 6 моль/дм3.
Автоклавируют не более 15 мин при температуре 121 "С.
А.4.1.5.18 Буферный раствор PBS, (NaCI) = 0.157 моль/дм3 (KCI) = 0.0027 моль/дм3. (Na2HP04) =
= 0.010 моль/дм3. (КН2Р04) = 0.0018 моль/дм3
Доводят значение pH до 7.5 ед. pH. используя HCI.
А.4.1.5.19 Суспензия диоксида кремния
Взвешивают 5 г диоксида кремния (А.4.1.5.13) в пробирке вместимостью 50 см3 и добавляют 50 см3буфера
PBS (А.4.1.5.18). Хорошо перемешивают и оставляют для осаждения на 2 ч. Надосадочную жидкость удаляют
путем отсасывания с помощью пипетки. Добавляют еще 50 см3буфера P8 S, хорошо перемешивают и оставляют
для осаждения на 2 ч. Образовавшуюся надосадочную жидкость удаляют. Центрифугируют в течение 2 мин
при ускорении 2000 д. Надосадочную жидкость отбрасывают. После центрифугирования повторно растворяют
осадок в пробирке 50 см3раствора II гуанидина гидрохлорида (А.4.1.5.17). Используют в течение 2—5 мес.
Хорошо пере мешивают перед использованием.
А.4.1.5.20БуфердляэкстрагированияTNE-SDS. (NaCI)=0.150 моль/дм3. (Трис)= 0.002моль/дм3.(№ 2ЭДТА) =
= 0.002 моль/дм3. (SDS) =10 г/дм3.
Доводят значение pH до 8.0 ед. pH. используя HCI или NaOH. и автоклавируют перед добавлением SDS.
А.4.1.5.21 Раствор изопропанола [СН3СН(ОН)СН3]. 80 %-ный.
А.4.1.5.22 Буферный раствор ТЕ. (Трис) = 0.010 моль/дм3. (Иа^ДТА) = 0.001 моль/дм3
Доводят значение pH до 8.0 ед. pH. используя HCI или NaOH.
А.4.1.5.23 Раствор рибонуклеазы-А массовой концентрации 10 мг/см3
Следует хранить в виде аликвот при температуре минус 20 "С, избегая многократного замораживания и
опаивания.
SIGMA S-5631 — пример подходящего коммерческого реактива. Эта информация приводится для удоб
ства пользователей настоящего стандарта и не означает обязательное использование только этого реактива. Мо
гут использоваться эквивалентные реактивы, если их применение приводит к тем же результатам.
21