ГОСТ РИСО 21571—2014
А.4.1.6 Оборудование
Используется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.
А.4.1.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение не менее 2000д.
На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.
А.4.1.6.2 Инкубатор с рабочей температурой 60 "С.
А.4.1.6.3 Встряхиватель. который должен помещаться внутри инкубатора (шейкер-инкубатор).
А.4.1.6.4 Смеситель, например. Vortex6’.
А.4.1.6.5 Пробирки для центрифугирования вместимостью 50 см3 для приготовления суспензии диоксида
кремния.
А.4.1.7 Методика
А.4.1.7.1 Общие положения
Сразу после приготовления анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить описан
ную ниже процедуру выделения и очистки ДНК.
При изменении размера навески сдобы требуется соответственно масштабировать массы реактивов и объ
емы буферов.
А.4.1.7.2 Методика выделения ДНК
Взвешивают 200—300 мг размолотого или измельченного материала в пробирке. Добавляют 2 см3 буфе
ра для экстрагирования (А.4.1.5.20) и 20 мм3 раствора протеиназы-К (А.4.1.5.15). Инкубируют в течение 1—5 ч
при температуре 60 "С. Во время инкубирования образцы необходимо интенсивно встряхивать (приблизительно
250 встряхиваний в мин). Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 2000д. Переносят 550
мм3образовав шегося верхнего слоя в новую пробирку.
Надосадочную жидкость обрабатывают 2 мм3раствора рибонуклеазы (А.4.1.5.23) в течение 5 мин при тем
пературе 37 "С (стадию гидролиза РНК рекомендуется проводить перед стадией связывания диоксидом кремния, в
противном случае гидролизованная РНК и полученные в результате нуклеотиды могут оказывать влияние на
последующие измерения на ультрафиолетовом спектрометре). Добавляют 55 мм3 раствора I гуанидина гидро
хлорида (А.4.1.5.16) и 100 мм3 суспензии диоксида кремния (А.4.1.5.19). Осторожно перемешивают несколько раз.
Пробирки оставляют на лабораторном столе приблизительно на 1 мин.
Центрифугируют в течение 2 мин при ускорении приблизительно 800д. Надосадочную жидкость отбрасыва
ют и добавляют 500 мм3 раствора изопропанола (А.4.1.21). Пробирки закрывают и перемешивают, желательно с
помощью смесителя (А.4.1.6.4). для повторного полного растворения осадка после центрифугирования.
Центрифугируют в течение 2 мин при ускорении приблизительно 1500д. Надосадочную жидкость отбрасы
вают и осадок после центрифугирования высушивают Добавляют 100 мм3 буферного раствора ТЕ (А.4.1.5.22).
Осторожно перемешивают для повторного растворения осадка после центрифугирования. Инкубируют при тем
пературе 60 "С в течение 5 мин. Центрифугируют в течение 5 мин при ускорении 2000д. Переносят 80 % образо
вавшегося верхнего слоя в новую пробирку. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не перенести частицы
диоксида кремния, которые оказывают ингибирующее воздействие на ферменты (например. ДНК-
лолимеразы. эндонуклеазы).
Перенесенный слой обрабатывают 2 мм3 раствора рибонуклеазы (А.4.1.5.23) в течение 1ч при температуре
37 "С или в течение всей ночи при комнатной температуре. Этот раствор является основным раствором ДНК.
А.4.1.8 Перечень примеров
Метод был успешно применен для экстрагирования ДНК1) из следующих продуктов: зародыши кукурузы1),
кукурузная мука, кукурузный глютеновый корм1), листья кукурузы, модифицированный кукурузный крахмал1), на
тивный кукурузный крахмал’>, семена кукурузы, кукурузная крупка, белок из соиЧ соя. листья сои. сахарная свекла
(свежие корнеплоды), сахарная свекла (замороженный жом), листья сахарной свеклы.
А.5 Получение ДНК. применимой для ПЦР. методами экстракции ДНК на основе
гуанидина-хлороформа
А.5.1 Основной метод на основе гуанидина-хлороформа
А.5.1.1 Общие положения
Данный метод пригоден для экстрагирования ДНК из большой группы пищевых продуктов и кормов
(см. А.5.1.8). В зависимости от состава пробы в некоторых случаях может потребоваться стадия дополнительной
очистки.
А.5.1.2 Статус валидации
Этот метод был проверен с применением процедуры внутрилабораторной проверки.
’) Повторяемость может зависеть от партии продукта и/или технологии его получения. В некоторых случаях
ДНК не может быть обнаружена или она подверглась расщеплению таким образом, что результаты ПЦР оказы
ваются ниже предела обнаружения метода независимо от используемых праймеров и/или протоколов ПЦР Это
может быть причиной низкой воспроизводимости результатов между лабораториями.
22