ГОСТ Р ИСО 21571—2014
Приложение А
(обязательное)
Методы экстракции ДНК
А.1 Получение применимой для ПЦР ДНК методами экстракции ДНК на основе фенола’хлороформа
А.1.1 Основной метод на основе фенола/хлороформа
А.1.1.1 Обшив положения
Настоящий метод является общепринятым (см. [5)) и применяется для экстракции ДНК из большой группы
продуктов (см. А.1.1.8).
Фенол обычно подходит для деструкции нуклеаз и денатурации белка.
При исследовании листьев или зеленой массы растений (например, листьев цикория, высушенной люцерны)
вместе с ДНК могут совместно осаждаться многие ингибиторы ПЦР. По этой причине могут возникнуть трудности,
связанные с воспроизводимостью получения ДНК. амплифицируемой в ПЦР.
С учетом агрессивных и опасных свойств фенола в качестве альтернативы целесообразно применять мето
ды экстрагированияДНК. основанные на ЦТАБ и^или поливинилпирролидоне (ПВП) и/или на адсорбциидиоксидом
кремния.
А.1.1.2 Статус валидации
Этот метод широко применяется во всех областях биологии, агрономии и медицины на протяжении 40 лет.
однако он никогда не подвергался оценке путем межлабораторных исследований для обнаружения ГМО в пище вых
продуктах.
А.1.1.3 Принцип метода
Метод включает стадию лизиса (термический лизис в присутствии додецилсупьфата натрия и высокой кон
центрации этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и последующее удаление загрязняющих примесей (напри
мер. липофильных молекул, полисахаридов и белков) и нуклеаз из водной фазы, содержащей ДНК. с помощью
фенола и хлороформа. Заключительное осаждение этиловым спиртом концентрирует ДНК и удаляет соли и оста
точный хлороформ. Критическим этапом метода является стадия лизиса {5J.
А.1.1.4 Меры предосторожности
Работы с органическими реактивами необходимо выполнять в вытяжном шкафу.
А.1.1.5 Реактивы
А.1.1.5.1 Этиловый спирт (С2Н5ОН). 96 %-ный
Следует хранить и использовать при температуре минус 20 "С.
А. 1.1.5.2 Ледяная уксусная кислота. СН3СООН.
А.1.1.5.3 Калия ацетат. С2Н30 2К.
А.1.1.5.4 Соляная кислота, HCI, 37 %-кая.
А.1.1.5.5 Изоамиловый спирт [(СН3)2СНСН2СН2ОН].
А.1.1.5.6 Фенол. С6Н5ОН.
А.1.1.5.7 Хлороформ. С Н а3.
А.1.1.5.8 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), СдН^ИОз.
А.1.1.5.9 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двукалиевая соль (К2ЭДТА). Cl0Hu N2O8K2.
А.1.1.5.10 Калия гидроксид. КОН.
А.1.1.5.11 Калия хлорид. KCI.
А.1.1.5.12 Натрия додецилсульфат (SDS). C12H250 4SNa.
А.1.1.5.13 Протеиназа К. приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.
А.1.1.5.14 Рибонуклеаза-А. выделенная из бычьей поджелудочной железы, очищенная от ДНК. приблизи
тельно 50000 ед./мг лиофилизата.
А.1.1.5.15 Уравновешенный фенол. > 7.8 ед. pH
Используется фенол, уравновешенный буфером для экстparирования/лизиса (А. 1.1.5.18), без SDS. или при
готовленный в соответствии с [5] или рекомендациями изготовителя.
А.1.1.5.16 Смесь хлороформ — изоамиловый спирт
Смешивают 24 объемные части хлороформа (А.1.1.5.7) и одну объемную часть изоамилового спирта
(А. 1.1.5.5).
А.1.1.5.17 Смесь фенол — хлороформ — изоамиловый спирт
Смешивают одну объемную часть уравновешенного фенола (А. 1.1.5.15) и одну объемную часть смеси хло
роформ — изоамиловый спирт (А.1.1.5.16).
А.1.1.5.18 Буфер для экстрагирования/лизиса
Молярные концентрации компонентов: Трис = 0.050 моль/дм3, К2ЭДТА = 0.050 моль/дм3: массовая концен
трация SDS = 30 г.’дм3. Доводят pH до 8.0 ед. pH. используя HCI или КОН.
7