ГОСТ Р 70152—2022
13.5.5 Способ приготовления сахарозо-желатиновой или глюкозо-желатиновой сред
К 100 мл дистиллированной воды добавляют 1 г желатина и 5 г сахарозы (5 г глюкозы). Дают по
стоять среде 2 ч при комнатной температуре. Затем стерилизуют в автоклаве при 120 °С в течение 30
мин.
В стерильных условиях микробные клетки, выращенные в бульоне (с сердечно-мозговой вытяж
кой, триптон-соевом, бруцелла, шадлера, мясо-пептонный идр.), отделяют в стерильных условиях цен
трифугированием, затем суспендируют осадок в защитной среде, чтобы получилась суспензия,
содер жащая не менее 106 кл/см3. Эту же процедуру применяют и в том случае, когда в качестве
защитной среды используется сахароза, декстран (10 %), лошадиная сыворотка, инозит и другие
вещества.
13.5.6 Заполнение ампул или пенициллиновых флаконов микробной суспензией
В каждую ампулу или пенициллиновый флакон из нейтрального стекла (45 * 10 мм) в зависимо
сти от ее объема наливают от 1до 3 см3, т. е. 20 % (вес/объем) суспензии с микробными клетками, со
держащей 10 % (вес/объем) стабилизатора-носителя, затем закрывают стерильной негигроскопической
ватной пробкой и подравнивают ее ножницами. После приготовления суспензии ее следует разлить
по ампулам как можно быстрее. Интервал между разливом и процессом лиофилизации должен быть
сведен до минимума, чтобы избежать осаждения клеток и других изменений в культуре. Вставляют ват
ные пробки на глубину приблизительно 1,3 см ниже края ампулы и обжигают их верхнюю часть, чтобы
убрать лишние волокна ваты.
13.5.7 Процедура лиофилизации
Готовые для лиофилизации флаконы с защитной средой и микробными культурами непосред
ственно перед лиофилизацией помещают в морозильные камеры на минус (70 ± 10) °С не менее чем на
16 ч, достают непосредственно перед процедурой лиофилизации и ставят в разогретую лиофильную
камеру. Общая продолжительность цикла высушивания составляет не более 50 ч. После высушивания
флаконы герметизируют в стерильных условиях.
13.5.8 Хранение
Лиофилизованные культуры хранят при температуре 4—6 °С. С понижением температуры растет
и сохраняемость микробных клеток. При комнатной температуре лиофилизованные культуры хранить
не рекомендуется.
13.6 Восстановление (реактивация) культур из лиофилизата
Лиофилизованную культуру переводят в суспензию сразу после вскрытия ампул, добавляя в каж
дую от 0,3 до 1,0 см3соответствующей стерильной жидкой среды. Суспензию в ампулах хорошо пере
мешивают и переносят в пробирки с 5 см3 жидкой среды (питательного бульона). После тщательного
перемешивания инокулят с культурами термостатируют в течение 2 ч в термостате при температуре
(37 ± 1) °С, затем отбирают 0,2 см3суспензии и наносят на твердую агаризованную питательную среду
или полужидкую среду того же состава (питательный бульон). Рост бактерий, подвергавшихся лиофи
лизации, часто начинается после длительной лаг-фазы. Поэтому нельзя делать заключение о гибели
культуры, если инкубация была недостаточно длительной.
13.7 Проверка жизнеспособности восстановленных бактерий после лиофилизации
Чтобы определить, насколько эффективен процесс высушивания бактерий из замороженного со
стояния, проверяют их жизнеспособность как до, так и после лиофилизации культуральным методом, а
также методом покраски на живые и мертвые с применением набора для флуоресцентной окраски
клеток или трипанового синего.
Для этого суспензию клеток стерильно разводят и делают посев штрихом на твердые среды. Про
бирки и чашки со средой инкубируют при оптимальной для бактерий температуре и, как только начина
ется их рост, делают пересев на свежую среду, чтобы убедиться в чистоте культуры.
При использовании метода оценки живых и мертвых бактерий 100 мкл бактериальной суспензии
смешивают 1:1 с флуоресцентной краской клеток или трипановым синим, пепетируют и проводят оцен ку
в камере Горяева под микроскопом.
13.8 Консервирование высушиванием из жидкого состояния
13.8.1 Подготовка клеток для L-высушивания
Для высушивания используют клеточную суспензию с плотностью не менее 108 кл/см3 в подхо
дящей защитной среде. В случае жидких культур клетки собирают стерильным центрифугированием
36