ГОСТ Р 70152—2022
После тщательного перемешивания на микровстряхивателе или на вортексе, заполненные крио
пробирки размещают в пластиковых контейнерах с ячейками, затем помещают в низкотемпературную
камеру или морозильник на минус (70 ± 10) °С или в жидкий азот на минус 196 °С.
Перед использованием замороженный образец достают из места хранения, помещают на 45 с в
водяную баню, прогретую заранее до (37 ± 1) °С, затем достают и размораживают при комнатной тем
пературе в анаэробных или аэробных условиях, требуемых для его культивирования.
При частой разморозке криопробирок титр микроорганизмов снижается, поэтому размораживать
несколько раз криопробирки с культурами не рекомендуется.
13.4.3 Процесс длительного хранения при низких температурах (криоконсервация) микро
организмов, выросших на поверхности агаризованных питательных сред
Микроорганизмы рассевают по всей поверхности чашки Петри на питательной среде. В начале
стационарной фазы роста микроорганизмы собирают с поверхности агара одноразовой бактериоло
гической петлей (при этом металлические петли использовать не рекомендуется из-за возможного по
вреждения клеточной стенки) или ватным тампоном и помещают в 800 мкл среды для криозаморозки или
криопротекторы, суспендируют с помощью микровстряхивателя или вортекса, затем помещают в
низкотемпературный морозильник на минус (70 ± 10) °С или в жидкий азот.
13.4.4 Внутриклеточные криопротекторы и криозащитные среды
Выбор криопротектора или криозащитной среды зависит от вида бактерий. При замораживании
новых штаммов следует предварительно проверить действие на них криопротектора.
13.4.4.1 Использование в качестве криопротектора 10%-ных растворов глицерина и ДМСО
Микроорганизмы помещают в криопробирки и добавляют по 1 см3 10%-ного раствора глицерина с
ДМСО, перемешивают и затем помещают криопробирки в морозильную камеру при минус (70 ± 10) °С
или в жидкий азот. Перед использованием криопробирку достают и размораживают при комнатной тем
пературе. При этом глицерин стерилизуют автоклавированием в течение 20 мин при 121 °С и хранят при
температуре 4—6 °С в течение 30 дней.
Стерилизацию ДМСО осуществляют фильтрованием, используя пористые свечи «Села» или
установку стерилизующей фильтрации. ДМСО собирают порциями по 10—15 см3 в стерильные про
бирки и хранят в замороженном состоянии при температуре минус 5 °С (ДМСО замерзает при темпе
ратуре минус 18 °С).
13.4.4.2 Использование в качестве криопротектора составных криозащитных сред
Подготавливают основу криозащитной среды из расчета на 500 см3дистиллированной воды, до
бавляют 2 г бактериологического сухого европейского агара, 2,5 г — NaCI, 1 г дрожжевого экстракта, 0,2
мг L-цистеин, 8,5 мг панкреатического гидролизата казеина, 5 г декстрозы. В 500 см3 дистиллиро ванной
воды постепенно добавляют вышеуказанные ингредиенты, размешивают и доводят до кипения, затем
кипятят в течение 5 мин до полного растворения бактериологического агара (оценку проводят
визуально, по отсутствию комков на предметном стекле, для чего опускают предметное стекло в при
готовленную среду, вынимают, дают возможность стечь и осматривают стекло на предмет отсутствия
комков), при этом pH среды поддерживают в диапазоне (7,2 ± 0,2), разливают в стерильные флаконы
емкостью 500 см3. Основу криозащитной среды разливают по емкостям и стерилизуют в течение 20 мин
при температуре 110 °С. Основа составной криозащитной среды представляет собой полужидкий вяз кий
стерильный раствор, полностью готовый к использованию для сохранения микроорганизмов в усло виях
низких и сверхнизких температур. Условия хранения составной среды — при температуре 4—6 °С в
течение 14 дней.
В стерильную основу криозащитной среды перед проведением заморозки культур микроорганиз
мов добавляют 10%-ный раствор глицерина в следующих пропорциях: на 100 см3 среды 14 см3 глице
рина; 200 см3— 28 см3 глицерина; 20 см3— 2,8 см3 глицерина; 30 см3— 4,2 см3глицерина; 40 см3—
5,6 см3 глицерина; 500 см3— 70 см3 глицерина.
10 %-ный раствор глицерина готовят из концентрата глицерина путем разведения стерильной
дистиллированной водой до соотношения 1:10 и стерилизуют в течение 20 мин при 121 °С. Хранят при
температуре 4—6 °С в течение 30 дней.
Бактериальные культуры смывают или снимают ватным тампоном или стерильной одноразовой
пластиковой бактериологической петлей (при этом металлические петли использовать не рекоменду
ется из-за возможного повреждения клеточной стенки) со всей поверхности питательной среды в крио
пробирки или пробирки типа Эппендорф, устойчивые к низким температурам, рассчитанные на 2 см3,
смешивают в соотношении 1:2 с криозащитной средой, перемешивают на вортексе в течение 2—5 мин
до получения однородной массы, затем криопробирки завинчивают крышкой или защелкивают и по-
34