ГОСТ 490—2006
Приложение А
(рекомендуемое)
Ферментативный метод определения изомеров молочной кислоты
Метод основан на окислении молочной кислоты (лактата) до пирувата коферментом НАД* в присутствии
L-лактатдегидрогеназы (L-ЛДГ) или D-лактатдегидрогеназы (0-ЛДГ). смещении равновесия реакции в сторону
образования пирувата и восстановленного НАД •Н путем преобразования пирувата в г.-аланин поддействием глу-
таматпируваттрансаминазы (ГПТ). фотометрическом определении концентрации образовавшегося НАД Н. экви
валентной концентрации молочной кислоты в пробе.
А.1 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы
Весы лабораторные с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более
± 1 мгпо ГОСТ 24104.
Спектрофотометр диапазоном измерения, позволяющим проводить исследования придлине волны 340 нм. с
допустимой погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1 %.
Кюветы фотометрические из оптического стекла или одноразовые полистироловые толщиной поглощающе
го свет слоя 1 см.
Шпатели пластмассовые или палочки стеклянные длиной от 10 до15 см.
Дозаторы липеточные с одноразовыми пластмассовыми наконечниками объемом доз 0.02; 0.1; 0,2 и 1.0 см3
или стеклянные микропипетки вместимостью от 0.1 до 0.5 см3.
Колба мерная 2-250-2 по ГОСТ 1770.
Пипетки градуированные 1-2-2-1. 1-2-2-10 по ГОСТ 29227.
Часы песочные на 5 мин.
Набор реактивов для определения 0- и L-молочных кислот фирмы Boehrlnger Mannheim (номер по каталогу
фирмы 1112821). включающий пять емкостей и рассчитанный приблизительно на 25 определений:
емкость 1 — 30 см3 глицилглицинового буфера с pH 10.0. Содержит
440 мг L-глутаминовой кислоты;
емкость 2 — 210 мг лиофилизованного кофермента НАД*;
емкость 3 — 0.7 см3 суспензии фермента глутаматпируваттрансаминазы
(ГПТ). 1100 единиц активности:
емкость 4 — 0.7 см3 раствора фермента 0-лактатдегидрогеназы
(0-ЛДГ). 3800 единиц активности.
емкость 5 — 0.7 см3 раствора фермента L-лактатдегидрогеназы
(L-ЛДГ), 3800 единиц активности.
Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, по метрологическим
характеристикам не уступающих перечисленным выше.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
А.2 Подготовка к испытанию
Раствор молочной кислоты готовят разбавлением исходной молочной кислоты дистиллированной водой в
2500 раз (коэффициент разбавления F = 2500). Для этого в мерную колбу вместимостью 250 см3 вносят 0.1 см3
молочной кислоты, доводят объем раствора водой до метки, тщательно перемешивают.
Раствор кофермента НАД*. Перед использованием в емкость 2 добавляют 6 см3дистиллированной воды.
Приготовленный раствор кофермента НАД* стабилен в течение трех недель при температуре плюс 4 X или двух
месяцев при минус 20 *С.
Растворы, вносимые в кюветы, должны иметь температуру (20 ± 2) ®С.
А.З Проведение испытания
Используют схему анализа, приведенную в методических рекомендациях фирмы Boehrlnger Mannheim (1).
Масса 0- иL-молочных кислот а растворе, внесенном вкюветудля фотометрирования.должна составлять от
0.3 до 20.0 мкг.
В фотометрические кюветы — контрольную и опытную пипеточными дозаторами вносят по 1 см3 буферного
раствора (емкость 1). по 0.2 см3 раствора кофермента НАД* (емкость 2. после разбавления), по0.02 см3суспензии
фермента ГПТ (емкость 3). Затем в контрольную кювету вводят 1 см3 дистиллированной воды, а в опыт ную
— 0.1 см3 разбавленного анализируемого раствора молочной кислоты и 0.9 см3дистиллированной воды.
Содержимое кювет перемешивают шпателями или стеклянными палочками, выдерживают 5 мин исразу про
водят измерение оптической плотности растворов в контрольной и опытной кюветах {А и ,А ,оп)относительно воды
при длине волны 340 нм.
24