ГОСТ Р ИСО 10993.4-99
линдричсскими каналами (диаметр 3 мм). Образцы помешают в основание полостей камеры в боксе с лами
нарным потоком обеспыленного воздуха. Камеру с исследуемыми и контрольными образцами в виде дисков
диаметром 18 мм (попять каждого обрата) заполняют физиологическим раствором, а затем на вытесне
ние — меченой тромбоиитарной массой.
Оптимальное время инкубации — 60 мин при температуре 3? ‘С и постоянном встряхивании. После
трехкратной промывки образцов в физиологическом растворе измеряют их активность, используя гамма-
счетчик.
Из-за хорошей воспроизводимости результатов контролем служат стеклянные диски из предметного
стекла. В ряде случаев в качестве контроля используют близкий ктестируемому образцу по составу и специфике
применения материал с известными медико-биологическими свойствами.
Количественной характеристикой метода является относительный показатель адгезии тромбоцитов ОНАТ,
который вычисляют по формуле
ОПАГ = Л ^ / .V,(В.4)
гдеN — активность исследуемого и контрольного образцов за одинаковое время, пропорциональная
количеству тромбоцитов, ад тезированных к соответствующим поверхностям.
В.4.2 М е т о д с к а н и р у ю щ е й э л е к т р о н н о й м и к р о с к о п и и (СЭМ) д л я о п р с-
д е л е н и як о л и ч е с т в а и с т е п е н иа к т и в а ц и иа д г с з и р о в а и н ы х т р о м б о ц и
т о в
В.4.2.1 Принцип метода
Адгезия тромбоцитов на поверхность материала сопровождается значительными морфологическими из
менениями клеток, степень выраженности которых пропорциональна степени активации тромбоцитов. Чем
сильнее воздействует материал на клетки, гем интенсивнее протекают процессы образования псевдоподий,
распластывании по поверхности и. наконец, формирования на поверхности агрегатов.
Адгезированные тромбоциты разделяют на зри класса:
- одиночные клетки с псевдоподиями и без них;
- полностью распластанные по поверхности тромбоциты;
- клеточные агрегаты.
Основными параметрами для характеристики процесса взаимодействия тромбоцитов с поверхностью,
регистрируемой методом СЭМ, служат:
- количество тромбоцитов, адтезированных на поверхность исследуемого материала (относительно
контрольного материала);
- количество клеток каждого из указанных выше классов (относительно контрольного материала);
- морфология одиночных клеток.
В.4.2.2 Средства контроля
Реактивы:
- спирт этиловый (50. 70, S0. 90 и 100 %-ный):
- 0.S5 %-ный раствор натрия хлорида;
- 2.5 %-ный раствор глютарового альдегида:
- 3.8 %-ный раствор натрия цитрата.
Оборудование:
- сканирующий электронный микроскоп:
- аппарат для ионного напыления;
- установка количественного анализа изображения или персональный компьютер с программой морфо
логического анализа.
В.4.2.3 Проведение анализа
Цельную кровь здорового донора отбирают в силиконизировинные пробирки, содержащие цитрат
натрия, в соотношении кровь/антикоагу.лянг 9:1. Затем кровь центрифугируют при ускорении 100 g в течение 20
мин для получения обогащенной тромбоцитами плазмы.
Образцы приводят в контакт с тромбоиитарной плазмой и инкубируют при комнатной температуре в
течение 10—30 мин. Время инкубации подбирают для исследуемого ряда образцов в отдельном эксперименте
так. чтобы количество адгетированных клеток было достаточным для количественного анализа. После этого
образны промывают в физиологическом растворе для удаления излишков тромбоиитарной плазмы. Образны
фиксируют 1 ч в 2,5 %-ном растворе глутарового альдегида и проводят дегидратацию н растворах спирта с
возрастающими концентрациями 50. 70, S0. 90 и 100 %, с последующей сушкой на воздухе.
Просмотр образцов после напыления на их поверхность слоя меди или золота толщиной -50 нм прово
дят на СЭМ при мощности 5 кВт и рабочих увеличениях 2000—7500.
Количественной характеристикой адгезии тромбоцитов яазястся относительный показатель адгезии тром
боцитов, который вычисляют по формуле (В.4). где <V. и AfMMt# — количество адтезированных клеток на
образце и контроле соответственно, подсчитанное на 25 микрополях, произвольно выбранных на разных
20