ГОСТР ИСО 7405—2011
Используют фильтры, состоящие из смеси ацетатцеллюлозы и нитроцеллюлозы, диаметром
47 мм. размер пор 0,45 мкмЧ
6.3.4 Приготовление проб
Готовят пробы в соответствии с 6.1. Исследование должно быть проведено на экстракте материа
ла и/или самом материале согласно руководству в ИСО 10993-5.
a) Для твердых материалов готовят круглые испытуемые пробы диаметром примерно 5 мм с
плоской поверхностью для обеспечения адекватного контакта с фильтром. Масса испытуемых проб не
должна превышать 3,5 г.
b
) Для застывающих материалов вводят свежесмешанный материал в кольца внутренним диа
метром 5 мм ивысотой 2 мм. При испытании материалов в свежесмешанном состоянии помещают коль ца
на фильтр до введения материала. При испытании после различных периодов застывания
наполняют кольца так, чтобы материал находился вровень с кромкой, идают ему застыть при темпера
туре (37
1
2) °С иотносительной влажности (90 *10)% до готовностидля испытания. Масса испытуемых
проб не должна превышать 3.5 г.
П р и м е ч а н и е — Подходящими инертными материалами являются стекло или PTFE.
c) Для жидких испытуемых проб или экстрактов впитывают 0.01 мл жидкости в боросиликатный
тонкостекольный фильтровый диск диаметром 5 мм, помещенный на агар.
П р и м е ч а н и е — Подходящие диски могут быть приготовлены из предфильтров.
6.3.5 Контроли
Используют положительные контрольные образцы, отрицательные контрольные образцы и эта
лонные материалы.
6.3.6 Процедура испытания
Культивируют клетки, пока они недостигнут конца фазы логарифмического роста. Помещают цел-
люлозоацетатные фильтры на дно достаточного числа чашек Петри и пилетируют 6 мл клеточной сус
пензии (2,5 х 10» клеткиУмл) в каждую. Инкубируют при температуре (37 ♦ 2) °С в водоиасыщенной
атмосфере с 5 % (объемная доля) углекислого газа в течение 24 ч. Если используют другие условия
культивирования клеток, необходимо предоставить обоснование. Пилетируют 5 мл свежеприготовлен
ного агара или смеси агарозы и культуральной среды (см. 6.2.6). содержащейся при температуре 48 °С, в
достаточное число чашек Петри идают затвердеть при комнатной температуре. Аспирируют избыточ ную
культуральную среду из чашек, содержащих целлюлозоацетатные фильтры, промывают фильтры
фосфатно-буферным физраствором (например, фосфатно-буферным физраствором Dulbecco) при
температуре (37 i 2) °С и помещают их поверх агара или агарозы клеточной стороной вниз. Наносят от
трехдо пяти испытуемыхпроб поверхфильтра в каждуючашку и инкубируют еще 2 ч и24 ч при темпера
туре (37
i
2) °С в водонасыщенной атмосфере с 5 % (объемная доля) углекислого газа. Следует убе
диться, что испытуемые пробы находятся в тесном контакте с поверхностью фильтра. Признаки
цитотоксичности должны быть оценены после периодов воздействия в 2 ч и 24 ч. В каждую чашку поме
щают один положительный контрольный образец и один отрицательный контрольный образец. Допол
нительно используют добавочные контрольные образцы фильтра с клеточным монослоем, но без
испытуемых проб, ифильтра без клеток, но с испытуемыми пробами. При испытании экстрактов необхо
димо также применить контрольный образец, используя только экстракционную среду. Осматривают
каждую испытуемую пробу по меньшей мере четыре раза.
После инкубации удаляют испытуемые пробы и осторожно высвобождают фильтр из агара или
агарозы. Оценивают с цитохимической точки зрения область пониженной активности клеточных фер
ментов методом А или методом В.
а) Метод А
Проявляют сукцинатдегидрогеназусогласно методу Барка и Андерсона (14). Инкубационный пери
од 3 ч при температуре (37 л2) еС. Промывают фильтр в дистиллированной воде и высушивают на воз
духе до измерения.
П р и м е ч а н и е — Удерживанию клеток может способствовать их фиксация с помощью 10 %-ного ней
трального формалина на 15 мин до промывания в дистиллированной воде.
Мllllpore НАТР 04700 является примером пригодного, коммерчески доступного продукта. Эта информация
приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой означенного изделия со
стороны ИСО. Возможно использование эквивалентных продуктов, если доказано, что они приведут к тем же ре
зультатам.
10